Notch信號(hào)通路在肺成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：探討γ-分泌酶抑制劑DAPT抑制Notch信號(hào)前后，在肺成纖維細(xì)胞中Notch信號(hào)通路受體Notch1、配體Jagged1及肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志因子α-SMA表達(dá)的變化，研究Notch信號(hào)通路在肺成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化中的作用。
　　 方法：采用胰酶消化法，從新出生2-3天的S-D大鼠肺組織中分離培養(yǎng)肺成纖維細(xì)胞，波形蛋白(Vimentin)免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定培養(yǎng)至第三代的成纖維細(xì)胞的純度，無(wú)血清培養(yǎng)基同步24h，再將細(xì)

2、胞分為對(duì)照組、TGF-β1組、TGF-β1+DAPT組；TGF-β1組及TGF-β1+DAPT組加入5ng/ml的TGF-β1誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，TGF-β1+DAPT組同時(shí)加入500nmol/l的DAPT抑制Notch信號(hào)的表達(dá)；分別采用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)α-SMA蛋白的表達(dá)變化，RT-PCR法檢測(cè)Notch1、Jagged1和α-SMA mRNA的表達(dá)變化，Western-blot法檢測(cè)Notch1、Jagged1和α

3、-SMA蛋白的表達(dá)變化；采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩樣本均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)，多個(gè)樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。
　　 結(jié)果：(1)Vimentin免疫細(xì)胞化學(xué)：幾乎100％細(xì)胞胞漿內(nèi)可見(jiàn)棕褐色顆粒及條紋，證明胰酶消化法培養(yǎng)至第三代的幾乎全為成纖維細(xì)胞；(2)α-SMA免疫細(xì)胞化學(xué)：未加藥物干預(yù)的對(duì)照組細(xì)胞中少部分細(xì)胞內(nèi)有淡黃色顆粒及條紋，TGF-β1組大部分細(xì)胞內(nèi)有黃色和黃褐

4、色顆粒及條紋，TGF-β1+DAPT組部分細(xì)胞內(nèi)有淡黃色顆粒及條紋；(3)α-SMAmRNA和蛋白表達(dá)：TGF-β1組α-SMA的mRNA和蛋白的相對(duì)吸光度值(0.851±0.027和0.785±0.020)較對(duì)照組(0.395±0.018和0.391±0.022)和TGF-β1+DAPT組(0.354±0.029和0.397+0.016)顯著升高，但對(duì)照組與TGF-β1+DAPT組比較則差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；(4)Notc

5、h1 mRNA和蛋白表達(dá)：TGF-β1組Notch1 mRNA和蛋白相對(duì)吸光度值分別為0.783±0.018和0.701±0.026，較對(duì)照組(0.278±0.022和0.312±0.019)和TGF-β1+DAPT組(0.313±0.029和0.345±0.022)明顯升高，而對(duì)照組和TGF-β1+DAPT組相比較則差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；(5)Jagged1mRNA和蛋白表達(dá)：TGF-β1組Jagged1 mRNA和蛋白相

6、對(duì)吸光度值(0.851±0.028和0.847±0.026)較對(duì)照組(0.392±0.021和0.394±0.027)和TGF±β1+DAPT組(0.404±0.024和0.409±0.026)升高顯著，對(duì)照組和TGF-β1+DAPT組相比較則差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)
　　 結(jié)論：胰酶消化法可培養(yǎng)出肺成纖維細(xì)胞。TGF-β1可以誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，轉(zhuǎn)化過(guò)程中Notch1、Jagged1和α-SMA mRN