低氧對新生小鼠心臟成纖維細(xì)胞增殖與表型的影響及其表型轉(zhuǎn)化機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：探討低氧對新生小鼠心臟成纖維細(xì)胞(cardiac fibroblasts，CFs)增殖與表型的影響及其表型轉(zhuǎn)化的相關(guān)機(jī)制。
　　方法：體外分離培養(yǎng)新生小鼠CFs，通過倒置顯微鏡觀察其形態(tài)，同時(shí)運(yùn)用免疫熒光染色和流式細(xì)胞技術(shù)檢測CFs特異性的標(biāo)記物盤狀結(jié)構(gòu)域受體2(DiscoidinDomain Receptor2，DDR2)。分別應(yīng)用Real-time RCR和Western Blot方法檢測低氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxi

2、a inducible factor-1α，HIF-1α)的表達(dá)。RT-CES系統(tǒng)監(jiān)視CFs的生長狀況；CCK-8法檢測CFs的增殖情況。分別通過Real-time RCR、免疫熒光染色、流式細(xì)胞技術(shù)和Western Blot技術(shù)從核酸和蛋白水平檢測CFs向心臟肌成纖維細(xì)胞(cardiac myofibroblasts，CMFs)表型轉(zhuǎn)化的標(biāo)記物α-平滑肌激動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)。運(yùn)用Weste

3、rn Blot技術(shù)檢測JNK的磷酸化水平。
　　結(jié)果：1.CFs的純度鑒定：分離培養(yǎng)的細(xì)胞呈梭形或多角形，胞體及細(xì)胞核較大，細(xì)胞核呈橢圓形，無自發(fā)性搏動，呈現(xiàn)出CFs的典型形態(tài)特征。Vimentin和DDR2的免疫熒光染色呈陽性。流式細(xì)胞技術(shù)檢測結(jié)果顯示，Vimentin和DDR2的陽性率分別為99.94％、94.76%。
　　2.低氧對CFs增殖的影響：常氧組、1%O2組和5%O2組中，CFs持續(xù)地表達(dá)HIF-1α mRN

4、A，它們之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與常氧組相比，1%O2組和5%O2組CFs中HIF-1α蛋白的表達(dá)顯著性增加(P<0.05)。與常氧組相比，在140h時(shí)期內(nèi)，1%O2組CFs的細(xì)胞指數(shù)值顯著性下降；5%O2組CFs的細(xì)胞指數(shù)值持續(xù)性上升，CFs未出現(xiàn)凋亡或死亡現(xiàn)象。與常氧組相比，5%O2組CCK-8 A450nm值顯著性增加(P<0.05)；1%O2組CCK-8 A450nm值顯著性降低(P<0.05)。
　　3.低

5、氧對CFs表型轉(zhuǎn)化的作用及其表型轉(zhuǎn)化的相關(guān)機(jī)制：常氧組CFs中α-SMA免疫熒光染色呈微弱陽性，5%O2組CFs中α-SMA免疫熒光染色呈強(qiáng)陽性。Real-time RCR和Western Blot結(jié)果顯示，與常氧組相比，5%O2組CFs中α-SMAmRNA和蛋白的表達(dá)水平顯著性增加(P<0.05)。流式細(xì)胞技術(shù)檢測的結(jié)果顯示，常氧組CFs中α-SMA的陽性率是15.24%，5%O2組CFs中α-SMA的陽性率是88.83%。Weste