睪酮對心肌成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的干預(yù)研究

1、摘要】目的觀察氧化應(yīng)激對心肌成纖維細(xì)胞(CF)表型轉(zhuǎn)化的影響以及睪酮的干預(yù)作用，初步探討睪酮抗心臟老化過程中心肌纖維化的機(jī)制。方法差速貼壁法培養(yǎng)雄性昆明白乳鼠心肌成纖維細(xì)胞，用β半乳糖苷酶瓤色檢測細(xì)胞的衰老，MTT法檢測細(xì)胞增殖能力，采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測肌成纖維細(xì)胞的典型標(biāo)記α平滑肌肌動蛋白（αSMA）。結(jié)果H2O2刺激下β半乳糖苷酶染色陽性細(xì)胞比例增加，心肌成纖維細(xì)胞增殖率降低，αSMA免疫化學(xué)染色出現(xiàn)明顯強(qiáng)陽性；睪酮

2、在3.0109、3.0108和3.0107molL3種濃度下均具有延緩H2O2誘導(dǎo)的以上效應(yīng)，氟他胺（Flu）能部分阻斷睪酮的各種保護(hù)作用。結(jié)論睪酮通過受體機(jī)制可以逆轉(zhuǎn)H2O2誘導(dǎo)的心臟成纖維細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)化，這可能是睪酮抗心臟老化過程中心肌纖維化的機(jī)制之一。【關(guān)鍵詞】睪酮氧化應(yīng)激；衰老心肌成纖維細(xì)胞表型Interventioneffectoftestosteroneonphenotypeofcardiacfibroblastsinduc

3、edbyoxidativestressLIUXinQiangWUSaiZhuXINGXiaoWenetal.DepartmentofCardiologyNanfangHospitalAffiliatedtoSouthernMedicalUniversityGuangzhou510515GuangdongChina【Abstract】ObjectiveToobservetheinterventioneffectoftestoster

4、oneonphenotypeofcardiacfibroblastsinducedbyoxidativestress.MethodsCardiacfibroblastfromventricleofheartofneonatalmaleKunmingmicewereculturedbydifferentialanchingvelocitymethod.TheexpressionofSAβgalineachgroupwasdetecte

5、dthroughsenescenceassociatedβgalstainingtheproliferationofcellswasdetectedbyMTTmethod.Proteinlevelofαsmoothmuscleactin(αSMA)whichwasthetypicalmarkofmyofibroblastwasmeasuredbyimmunostaining.ResultsComparedtocontrolgro

6、upH2O2causedmecellularsenescencedepressedtheproliferationofcellstheexpressionofαSMAwassignificantlystimulated.Undertheseconcentrations(310931083107molL)testosteronepretreatmentofcellssignificantlyattenuatedalltheseeffec

7、tsofH2O2exposure.Flutaeadministeredpritotestosterone(3108molL)pretreatmentpartlyantagonizedtheprotectiveeffectsoftestosteroneagainstH2O2exposure.ConclusionsThereversingeffectsoftestosteroneonthephenotypeconversionofcardi

8、acfibroblastsmediatedbytherogenreceptsmightbeoneofthemechanismsffightingagainstcardiacfibrosisduringagingprocessofheart.【Keywds】TestosteroneOxidativestressSenescenceCardiacfibroblastsPhenotype心臟老化的過程中心肌纖維化發(fā)生的幾率逐漸增加。研究表明隨

9、著年齡的增長，男性體內(nèi)睪酮水平逐漸下降游離睪酮和生物活性睪酮水平降低更為顯著與此同時性激素靶器官的功能隨之發(fā)生顯著變化〔1〕。而在老年人中睪酮水平的低下與心肌纖維化的程度密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)對培養(yǎng)的心肌成纖維細(xì)胞進(jìn)行氧化應(yīng)激處理，觀察睪酮對其衰老和表型轉(zhuǎn)化的干預(yù)作用，探討睪酮抗心臟老化過程中心肌纖維化的機(jī)制。1材料與方法比較行單向方差分析和LSD多重比較。2結(jié)果2.1各組細(xì)胞增殖率的比較與空白對照組比較，H2O2刺激組可以引起心肌成纖維細(xì)胞

10、增殖率明顯下降（P=0.000）。生理濃度（3.0108molL）的睪酮與稍高于或低于生理濃度(3.0107、3.0109molL)的睪酮都具有增加H2O2誘導(dǎo)的HUVECs增殖率的趨勢，與H2O2刺激組比較均有顯著差異(P=0.000)。生理濃度睪酮作用最顯著(P=0.000)。而稍高于或低于生理濃度之間無顯著差異(P=0.994)。Flu卻可以增加H2O2誘導(dǎo)的HUVECs的增殖率，差異也具有顯著性(P=0.000)。見表1。2.2

11、各組SAβGal染色陽性率比較與空白對照組相比，H2O2刺激組陽性細(xì)胞率增多具有顯著性意義(P=0.000)；而生理濃度（3.0108molL）的睪酮與稍高于或低于生理濃度(3.0107、3.0109molL)的睪酮都能干預(yù)H2O2的作用(P=0.000)；生理濃度與稍高于生理濃度睪酮相比無顯著性差異(P=0.060)。而Flu即可阻斷睪酮的保護(hù)作用，差異也具有顯著性(P=0.000)。見表1。2.3各組細(xì)胞內(nèi)ROS水平的比較各組細(xì)

12、胞內(nèi)ROS水平存在顯著差異（采用單向方差分析檢驗(yàn)，F(xiàn)=933.04，P=0.000）。其中，與空白對照組相比，H2O2刺激組的細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著上升(P=0.000)；而生理濃度（3.0108molL）的睪酮與稍高于或低于生理濃度(3.0107、3.0109molL)的睪酮都能干預(yù)H2O2的作用(P=0.000)，而生理濃度與稍高于生理濃度相比無顯著性差異(P=0.063)。而Flu即可阻斷睪酮的保護(hù)作用，差異也具有顯著性(P=0.0

13、00)。見圖1。2.4各組αSMA陽性表達(dá)情況空白對照組心肌成纖維的αSMA免疫化學(xué)染色部分細(xì)胞輕度著色，無明顯的結(jié)構(gòu)定位特征(見圖2A箭頭所指為輕度著色細(xì)胞，著色無明顯的結(jié)構(gòu)定位)。H2O2刺激組αSMA免疫化學(xué)染色出現(xiàn)明顯強(qiáng)陽性，雖然不同細(xì)胞的染色強(qiáng)度不完全一致，但結(jié)構(gòu)定位明顯，呈絲狀分布(見圖2B箭頭所指為呈明顯陽性染色的細(xì)胞)。低于生理濃度的睪酮（3.0109molL）作用后染色明顯，結(jié)構(gòu)定位明顯（見圖2C箭頭所指為呈明顯

14、陽性染色的細(xì)胞）。干預(yù)組生理濃度的睪酮與稍高于生理濃度的睪酮（3.0107molL）干預(yù)組僅有部分細(xì)胞輕度著色，無明顯的結(jié)構(gòu)定位特征(見圖2D、E箭頭所指為輕度著色細(xì)胞，著色無明顯的結(jié)構(gòu)定位)。睪酮Flu組細(xì)胞出現(xiàn)明顯強(qiáng)陽性（見圖2F箭頭所指為呈明顯陽性染色的細(xì)胞）。實(shí)驗(yàn)以不同批次的細(xì)胞重復(fù)5次。2.5心肌成纖維細(xì)胞胞漿內(nèi)αSMA含量見表1。與空白組相比，H2O2刺激組的細(xì)胞內(nèi)αSMA含量顯著上升(P=0.000)；而生理濃度（3.