Wnt-β-catenin信號通路在TGF-β1誘導(dǎo)的真皮成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化中作用和機(jī)制的研究.pdf

1、【研究背景】
　　增生性瘢痕是皮膚組織損傷后，創(chuàng)面愈合中過度纖維化的產(chǎn)物。肌成纖維細(xì)胞由成纖維細(xì)胞經(jīng)表型轉(zhuǎn)化而來，是導(dǎo)致增生性瘢痕形成的主要效應(yīng)細(xì)胞。研究表明，TGF-β1是誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵刺激因素。TGF-β1除由經(jīng)典的Smad分子介導(dǎo)其下游信號傳導(dǎo)外，還與Wnt信號通路存在交互調(diào)控機(jī)制，共同參與多種生理病理過程。Wnt信號是調(diào)控器官和組織發(fā)育、干細(xì)胞分化的重要信號通路，已有報道提示它可能參與了創(chuàng)面愈合

2、、纖維化疾病的發(fā)生、纖維化效應(yīng)細(xì)胞的激活，但是具體作用可能存在組織器官特異性，潛在分子機(jī)制不明。特別是Wnt信號在真皮成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化中的作用，及其與TGF-β1信號的交互調(diào)控作用如何，尚不明確。
　　【研究目的】
　　1.明確增生性瘢痕組織及瘢痕成纖維細(xì)胞中，Wnt通路關(guān)鍵信號分子的表達(dá)調(diào)控機(jī)制。
　　2.明確外源調(diào)控Wnt信號對TGF-β1誘導(dǎo)的真皮成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的具體作用，并初步探討其作用機(jī)制。
　　

3、【研究內(nèi)容】
　　1.采用實(shí)時熒光定量PCR方法，對增生性瘢痕組織和瘢痕成纖維細(xì)胞中Wnt通路相關(guān)分子的表達(dá)進(jìn)行檢測。
　　2.用TGF-β1誘導(dǎo)正常真皮成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，采用實(shí)時熒光定量PCR和免疫印跡法，分別檢測成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中Wnt通路關(guān)鍵信號分子的表達(dá)變化。
　　3.使用SB216763活化Wnt通路，采用實(shí)時熒光定量PCR、免疫印跡、細(xì)胞免疫熒光等方法，檢測成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化標(biāo)志分子表達(dá)特性的變化；用成

4、纖維細(xì)胞三維凝膠收縮實(shí)驗(yàn)檢測成纖維細(xì)胞收縮功能的改變。
　　4.構(gòu)建β-catenin過表達(dá)載體，合成siRNA片段。
　　5.轉(zhuǎn)染β-catenin過表達(dá)載體或siRNA片段，用實(shí)時熒光定量PCR、免疫印跡、細(xì)胞免疫熒光等方法，檢測成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化標(biāo)志分子表達(dá)特性的改變。
　　6.用Wnt通路激活劑和轉(zhuǎn)染β-catenin過表達(dá)載體的方法干預(yù)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞，實(shí)時熒光定量PCR和免疫印跡法檢測α-SMA、Ⅰ/Ⅲ

5、型膠原、TGF-β1、Smad3、Smad7的表達(dá)變化。
　　7.用重組Wnt細(xì)胞因子干預(yù)成纖維細(xì)胞，觀察其對成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的作用。
　　【研究結(jié)果】
　　1.與自體正常皮膚相比，增生性瘢痕組織中Wnt2、Wnt3a、Wnt4、Wnt10b的表達(dá)水平顯著下調(diào)。同樣，與正常真皮成纖維細(xì)胞相比，增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中Wnt2、Wnt4、Wnt10b的表達(dá)水平也顯著下調(diào)。
　　2.正常成纖維細(xì)胞經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)轉(zhuǎn)

6、分化過程中，Wnt2、Wnt4、Wnt10b的mRNA水平均顯著上調(diào)。TGF-β1對β-catenin的mRNA水平?jīng)]有明顯的影響，但可以顯著上調(diào)其蛋白表達(dá)水平。
　　3.用Wnt/β-catenin激活劑SB216763與TGF-β1共同作用于正常成纖維細(xì)胞后，TGF-β1誘導(dǎo)的α-SMA，Ⅰ/Ⅲ型膠原的表達(dá)被顯著抑制；細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示，α-SMA陽性的肌成纖維細(xì)胞數(shù)量顯著減少。三維凝膠收縮實(shí)驗(yàn)顯示，SB216763作用后，

7、成纖維細(xì)胞的收縮功能被顯著抑制。
　　4.成功構(gòu)建了β-catenin真核表達(dá)載體，合成siRNA片段。
　　5.β-catenin過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞后，顯著抑制了TGF-β1誘導(dǎo)的α-SMA、Ⅰ/Ⅲ型膠原的表達(dá)；細(xì)胞免疫熒光顯示，β-catenin轉(zhuǎn)染后，α-SMA陽性的肌成纖維細(xì)胞數(shù)量顯著減少；而β-catenin表達(dá)被抑制后，TGF-β1誘導(dǎo)的α-SMA、Ⅰ/Ⅲ型膠原的表達(dá)水平進(jìn)一步上調(diào)。
　　6.SB21

8、6763和β-catenin過表達(dá)干預(yù)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞后，α-SMA和Ⅰ/Ⅲ型膠原的表達(dá)被顯著抑制；TGF-β1和Smad3的mRNA水平被SB216763下調(diào)，而Smad7表達(dá)水平未出現(xiàn)顯著變化。
　　7.Wnt4作用于成纖維細(xì)胞，抑制了TGF-β1誘導(dǎo)的α-SMA和Ⅰ/Ⅲ型膠原的表達(dá)；抑制TGF-β1的自分泌機(jī)制；還能使肌成纖維細(xì)胞發(fā)生逆分化。
　　【研究結(jié)論】
　　1.真皮成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化中，TGF-β1可

9、能通過上調(diào)Wnt2、Wnt4、Wnt10b這些Wnt配體分子，激活Wnt/β-catenin信號通路，直接在蛋白水平活化β-catenin。
　　2.外源活化Wnt/β-catenin可以抑制TGF-β1誘導(dǎo)的真皮成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，對TGF-β1誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化起負(fù)反饋調(diào)控作用。
　　3.外源激活Wnt/β-catenin信號，可抑制增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中α-SMA和Ⅰ/Ⅲ型膠原的表達(dá)。
　　4.Wnt/β-