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文檔簡介
1、目的:肺干細胞的增殖分化及穩(wěn)態(tài)維持的失衡與多種呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),可能導(dǎo)致呼吸系統(tǒng)不同程度的病理改變和功能受損,因此探究肺干細胞損傷修復(fù)機制對于呼吸系統(tǒng)疾病的病生理機制研究及診斷治療具有重要的指導(dǎo)意義。肺上皮細胞覆蓋于呼吸道表面,保持氣道和肺泡上皮結(jié)構(gòu)的完整,同時維持肺功能的穩(wěn)定。當(dāng)肺上皮受到損傷后,可通過肺干細胞的自我更新及損傷修復(fù)來維持和恢復(fù)其數(shù)量和功能。肺上皮的修復(fù)存在多種機制,肺外干細胞(骨髓、外周血、胚胎等來源)可
2、遷移到損傷的肺部對上皮進行修復(fù),但肺內(nèi)干細胞對氣道上皮修復(fù)的貢獻遠遠大于肺外干細胞,目前已知的肺內(nèi)干細胞包括基底細胞、Club細胞、支氣管肺泡干細胞及Ⅱ型肺泡細胞等。肺部干細胞的功能受其所處微環(huán)境包括成纖維細胞、毛細血管以及氣道壁平滑肌細胞等的緊密調(diào)控。成纖維細胞可以分泌轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor beta,TGF-β),TGF-β通路可以促進干細胞分化、抑制增殖,但成纖維細胞是否利用 TGF
3、-β通路實現(xiàn)對干細胞的調(diào)控尚未見報道,本研究利用分子生物學(xué)和細胞生物學(xué)等手段,探究 TGF-β通路在成纖維細胞調(diào)控氣道上皮干細胞增殖中的作用機制,為增強氣道上皮修復(fù)的治療新方法提供理論依據(jù)。
方法:
1、利用酶消化法分離小鼠肺氣道上皮細胞,流式細胞術(shù)篩選肺氣道上皮干細胞。
2、對氣道上皮干細胞進行體外培養(yǎng),除對照組只加入基本培養(yǎng)基外,實驗組分別加入不同種類的肺成纖維細胞分泌的生長因子(FGF1、FGF2、F
4、GF10、HGF)、TGF-β受體抑制劑 SB431542、肺成纖維細胞、肺成纖維細胞+TGF-β抑制劑SB431542,利用倒置熒光顯微鏡觀察、比較氣道上皮干細胞增殖情況。
3、用敲除肺干細胞TGF-β受體的小鼠(TGFβR-肺干細胞、SPC-Cre/TGFβRf/f)為實驗組,未敲除基因小鼠為對照組,分別篩選氣道上皮干細胞進行體外培養(yǎng),培養(yǎng)時實驗組與對照組各自分別加入基本培養(yǎng)基及TGF-β受體抑制劑SB431542,利用倒
5、置熒光顯微鏡觀察氣道上皮干細胞增殖情況,并對干細胞克隆數(shù)量進行統(tǒng)計學(xué)分析。
4、對肺成纖維細胞系MLg進行體外培養(yǎng),設(shè)立實驗組及對照組,對照組加入基本培養(yǎng)基,實驗組細胞培養(yǎng)過程中加入TGF-β受體抑制劑SB431542,處理48小時后利用顯微鏡觀察細胞的數(shù)量及形態(tài)變化,提取細胞 RNA,應(yīng)用實時定量PCR方法(qRT-PCR)測定成纖維細胞分泌的不同生長因子(FGF1、FGF2、FGF4、FGF10、HGF)的基因表達量。
6、r> 結(jié)果:
1、肺氣道上皮干細胞的流式篩選結(jié)果:除去細胞碎片和7-AAD陽性標(biāo)記的死細胞,分餾出肺組織活細胞;除去CD31/34/45-APC-CY7標(biāo)記的內(nèi)皮細胞、基質(zhì)細胞和造血細胞,EpCAM-PE-CY7陽性標(biāo)記的細胞為上皮細胞;最后上皮細胞中Sca-1-APC和GFP-FITC雙陽性標(biāo)記的細胞即為氣道上皮干細胞。
2、肺成纖維細胞分泌的生長因子對氣道上皮干細胞的增殖起促進作用。
3、TGF-β通
7、路對氣道上皮干細胞的增殖無直接調(diào)控作用。
4、肺成纖維細胞通過抑制TGF-β通路間接促進氣道上皮干細胞的增殖。
5、TGF-β受體抑制劑SB431542對肺成纖維細胞的形態(tài)及數(shù)量無明顯影響。
6、TGF-β受體抑制劑SB431542可上調(diào)肺成纖維細胞分泌的生長因子的基因表達水平。
結(jié)論:肺成纖維細胞通過抑制TGF-β通路上調(diào)其分泌的生長因子(FGFs、HGF)的基因表達水平,進而促進氣道上皮干細胞
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