iNOS抑制劑AG和1400W對大鼠肺成纖維細胞CTGF表達和肌成纖維細胞表型轉化的影響.pdf

1、目的：肺纖維化(pulmonary fibrosis，PF)是一種由多種因素引起的肺間質性病變。肺纖維化時，肺間質中的膠原纖維大多由肌成纖維細胞(Myofibroblast，MFb)合成。肌成纖維細胞是以表達α-平滑肌肌動蛋白(smooth musle actin，α-SMA)為標志的成纖維細胞。氨基胍(aminoguanidine，AG)是誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxidesynthase，iNOS)抑制

2、劑；1400W是一種選擇性較強的高效iNOS抑制劑。AG或1400W對于離體肺成纖維細胞結締組織生長因子(connective tissuegrowth factor，CTGF)及肌成纖維細胞表型轉化的影響目前尚未見報道。RNA干擾(RNA interference，RNAi)作為一種新興的基因水平調控技術，通過合成特異性小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)沉默靶基因的表達，已成為基因功能研究和基因治療

3、的全新手段。因此，本實驗通過離體觀察AG和1400W對大鼠肺成纖維細胞CTGF及α-SMA蛋白表達的影響；并利用CTGF siRNA技術闡明AG和1400W對肺成纖維細胞CTGF及肌成纖維細胞表型轉化影響的機制，為評價iNOS抑制劑在肺纖維化防治中的作用提供資料。
　　方法：體外分離培養(yǎng)原代雄性SD大鼠(130-150g)肺成纖維細胞；MTT法測定AG和1400W對肺成纖維細胞存活率的影響；Western Blot法測定肺成纖維細

4、胞CTGF及α-SMA的蛋白表達。
　　結果：
　　1 TGF-β誘導肺成纖維細胞CTGF蛋白表達的最佳時間點
　　基礎狀態(tài)的肺成纖維細胞是指正常培養(yǎng)的肺成纖維細胞。與相應的對照組相比，24 h、48 h、72 h CTGF的表達均上調(P<0.01)，與24 h、72 h時間點相比，48 h時間點上調更明顯(P<0.05)。因此，本實驗將48 h定為TGF-β誘導基礎狀態(tài)的肺成纖維細胞CTGF蛋白表達的最佳時間點。<

5、br>　　TGF-β處理后的細胞是指經(jīng)TGF-β(10 ng/ml)刺激48 h的肺成纖維細胞。與相應的對照組相比，TGF-β誘導24 h、48 h、72 h時TGF-β處理后的肺成纖維細胞CTGF蛋白表達均上調(P<0.05，P<0.01)。
　　2不同濃度的AG和1400W對基礎狀態(tài)及TGF-β處理后的肺成纖維細胞存活率的影響
　　與對照組相比，1 mmol/L AG對兩種狀態(tài)的肺成纖維細胞的作用均無無統(tǒng)計學意義(P>0

6、.05)，而當AG濃度達到5 mmol/L、10 mmol/L、20mmol/L、30 mmol/L、40 mmol/L或50 mmol/L時，其存活率顯著增高(P<0.01，P<0.001)。
　　與對照組相比，1400W隨濃度變化對兩種狀態(tài)的肺成纖維細胞存活率的影響均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　3 AG和1400W對肺成纖維細胞CTGF及α-SMA蛋白表達的影響
　　3.1不同濃度的AG和1400W對基礎狀

7、態(tài)的肺成纖維細胞CTGF蛋白及α-SMA表達的影響
　　與對照組相比，0.1 mmol/L的AG對基礎狀態(tài)的肺成纖維細胞CTGF及α-SMA蛋白表達無顯著性差異(P>0.05)，1 mmol/L的AG明顯上調CTGF及α-SMA蛋白表達(P<0.01)，而10 mmol/L、20 mmol/L、30 mmol/L的AG則劑量依賴性下調肺成纖維細胞的CTGF及α-SMA蛋白表達(P<0.05，P<0.01)。說明低濃度AG(1 mm

8、ol/L)誘導基礎狀態(tài)的肺成纖維細胞CTGF及α-SMA蛋白表達上調，而高濃度AG(10 mmol/L、20 mmol/L、30 mmol/L)抑制其表達。
　　與對照組相比，20 nmol/L的1400W明顯上調肺成纖維細胞CTGF及α-SMA蛋白表達(P<0.05)，40 nmol/L和80 nmol/L均無顯著性差異(P>0.05)，160 nmol/L顯著下調其表達(P<0.05)。說明低濃度1400W(20nmol/L)

9、誘導基礎狀態(tài)的肺成纖維細胞CTGF及α-SMA蛋白表達上調，而高濃度1400W(160 nmol/L)抑制其表達。
　　3.2不同時間點AG和1400W對基礎狀態(tài)的肺成纖維細胞CTGF及α-SMA蛋白表達的影響
　　與相應的對照組相比，AG(1 mmol/L)24 h肺成纖維細胞CTGF及α-SMA蛋白表達上調無顯著性差異(P>0.05)，48 h、72 h CTGF蛋白表達均上調(P<0.001，P<0.05)，48 h、

10、72 hα-SMA蛋白表達均明顯上調(P<0.01，P<0.05)。與72 h時間點相比，48 h時間點CTGF及α-SMA蛋白表達上調更明顯(P<0.01，P<0.05)，因此，本實驗將48 h定為AG(1 mmol/L)對肺成纖維細胞CTGF及α-SMA蛋白表達的最佳時間點。
　　與相應的對照組相比，1400W(20 nmol/L)24 h、48 h CTGF及α-SMA蛋白表達均上調(P<0.05，P<0.01)，72h時間

11、點無明顯變化(P>0.05)。與24 h時間點相比，48 h CTGF及α-SMA蛋白表達上調更明顯(P<0.05)。因此，48 h CTGF及α-SMAF蛋白表達上調最明顯。
　　4不同濃度的AG和1400W對TGF-β處理的肺成纖維細胞CTGF及α-SMA蛋白表達的影響
　　與基礎狀態(tài)的肺成纖維細胞組相比，TGF-β處理組CTGF及α-SMA蛋白表達均上調(P<0.01)。與TGF-β處理組相比，TGF-β+AG(1 m

12、mol/L)組CTGF及α-SMA蛋白表達無顯著差異(P>0.05)，TGF-β+AG(10mmol/L、20 mmol/L、30 mmol/L)則劑量依賴性下調肺成纖維細胞CTGF及α-SMA蛋白表達(P<0.05，P<0.04)。說明低濃度1mmol/L AG對TGF-β處理的肺成纖維細胞CTGF及α-SMA蛋白表達無明顯影響，高濃度10mmol/L、20 mmol/L、30 mmol/L AG抑制其表達。
　　與基礎狀態(tài)細胞

13、組相比，TGF-β處理組CTGF及α-SMA蛋白表達明顯上調(P<0.01)。與TGF-β組相比，TGF-β+1400W(10 nmol/L、20 nmol/L)組CTGF及α-SMA蛋白表達無顯著性差異(P>0.05)，TGF-β+1400W(40nmol/L、80 nmol/L)組抑制CTGF及α-SMA蛋白表達(P<0.05，P<0.01)。
　　5抑制效果最佳的CTGF siRNA特異靶序列的篩選
　　與NC siR

14、NA相比，6737 siRNA組CTGF和α-SMA的表達均有所下調(P<0.01，P<0.05)，6738 siRNA組CTGF和α-SMA的表達下調(P<0.05)，兩組對CTGF抑制率分別為(42±5)%、(29±4)%。以6737 siRNA下調最明顯(P<0.01)。說明6737 siRNA對CTGF的抑制效果最佳。
　　6 CTGF-siRNA對AG或1400W誘導的肺成纖維細胞CTGF及α-SMA蛋白表達的影響

15、>　　與NC組相比，6737 siRNA下調CTGF及α-SMA蛋白表達(P<0.05)。與AG(1 mmol/L)組相比，AG+NC組對CTGF及α-SMA蛋白表達無明顯影響(P>0.05)。與AG+NC組相比，AG+6737 siRNA組CTGF及α-SMA蛋白表達明顯下調(P<0.01)，AG+6738 siRNA組CTGF及α-SMA蛋白下調(P<0.05)。說明6737 siRNA、6738 siRNA對AG誘導的CTGF的表

16、達均有抑制作用，抑制率分別為(41±6)%、(24±4)%，并導致α-SMA蛋白表達下調。
　　與1400W+NC組相比，1400W+6737 siRNA組和1400W+6738 siRNA組CTGF及α-SMA蛋白表達均明顯下調(P<0.01，P<0.05)。
　　結論：
　　1低濃度的AG(1 mmol/L)和1400W(20 nmol/L)可誘導基礎狀態(tài)的肺成纖維細胞CTGF蛋白表達，并促進肌成纖維細胞表型轉化；

17、而高濃度AG(10 mmol/L、20 mmol/L、30 mmol/L)和1400W(160 nmol/L)可下調肺成纖維細胞CTGF及α-SMA蛋白表達。
　　2低濃度的AG(1 mmol/L)和1400W(20 nmol/L)對TGF-β誘導的肺成纖維細胞CTGF及α-SMA蛋白表達無明顯影響；高濃度的AG(10mmol/L、20 mmol/L、30 mmol/L)抑制其表達。
　　3 CTGF siRNA可阻斷AG(