蚯蚓活性蛋白促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖的作用及信號(hào)通路研究.pdf

1、成纖維細(xì)胞是創(chuàng)傷愈合過程中對(duì)組織再生、修復(fù)和重建功能至關(guān)重要的細(xì)胞，能夠分泌膠原等細(xì)胞外基質(zhì)成分和多種生長(zhǎng)因子，促進(jìn)傷口愈合。近年來，蚯蚓作為中國傳統(tǒng)中藥，普遍用于祛瘀和刺激傷口愈合等藥理活性的研究，且有很多研究結(jié)果表明蚯蚓提取物能夠促進(jìn)創(chuàng)面愈合。然而，蚯蚓是如何作用于創(chuàng)面并促進(jìn)組織存活的尚未知。本課題是以從鮮蚯蚓為原料，針對(duì)其促增殖作用進(jìn)行工藝優(yōu)化得到的蚯蚓活性蛋白(EAP)，研究EAP對(duì)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞NIH/3T3細(xì)胞的活性作用

2、，并探討EAP促進(jìn)NIH3T3細(xì)胞增殖的信號(hào)通路。研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下:
　　 1、蚯蚓蛋白提取工藝的優(yōu)化及分離純化。
　　 結(jié)合實(shí)驗(yàn)室前期研究，首先以MTT活性篩選方法，著重考察了鹽析條件和脫鹽條件對(duì)蚯蚓蛋白提取物活性的影響，并通過正交設(shè)計(jì)考察溶劑、溫度、鹽飽和度對(duì)蚯蚓粗蛋白活性的影響，確定了最優(yōu)的提取工藝，即鮮蚯蚓加入兩倍量的pH7.8的磷酸鹽緩沖液冰浴勻漿，4℃靜置4h，離心25min，取上清鹽析至50％飽和度，4℃

3、靜置1h，離心25min，上清液用0.2μm的中空纖維膜組件超濾的方式除去大分子，然后用截留分子量為20k-50k中空纖維膜組件超濾的方式除鹽。后面按照分離純化流程，經(jīng)過DEAE離子交換層析、S200凝膠柱層析和TSK高效凝膠層析得到EAP。
　　 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析得到的EAP為較單一的電泳純蛋白，其分子量為58.84kDa，苯酚硫酸法測(cè)定糖含量為13.77％，雙向電泳測(cè)定蛋白等電點(diǎn)為4左右，HPLC-ELSD分析

4、含有11種已知氨基酸和多種未知成分。
　　 2、蚯蚓蛋白對(duì)NIH3T3細(xì)胞增殖和遷移的作用
　　 通過MTT活性檢測(cè)和Brdu摻入方法檢測(cè)不同濃度EAP對(duì)NIH3T3細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果說明EAP能夠以劑量依賴的方式促進(jìn)NIH3T3成纖維細(xì)胞DNA的復(fù)制，促進(jìn)其增殖;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果說明，EAP能夠以劑量依賴的促進(jìn)NIH3T3細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)變，顯著提高S期細(xì)胞比例;Western Blotting檢測(cè)調(diào)控

5、G1/S期檢驗(yàn)點(diǎn)的CyclinD1蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示EAP作用后，CyclinD1表達(dá)水平有顯著性提高。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell小室的結(jié)果共同說明，EAP具有促進(jìn)NIH3T3細(xì)胞遷移的活性，且其促細(xì)胞遷移作用具有劑量依賴性。
　　 3、EAP促進(jìn)細(xì)胞增殖的具體信號(hào)通路及對(duì)細(xì)胞周期的影響。
　　 首先選用不同的信號(hào)通路抑制劑，分別研究了EAP促進(jìn)細(xì)胞增殖作用過程中不同信號(hào)通路的參與情況。MTT和Western bl

6、otting結(jié)果顯示，MEK抑制劑PD98059和U0126預(yù)處理均可以顯著抑制細(xì)胞增殖作用，并明顯阻斷EAP激活的ERK磷酸化。流式細(xì)胞術(shù)和Western blotting分別檢測(cè)加入U(xiǎn)0126后細(xì)胞周期和Cyclin D1蛋白表達(dá)水平，結(jié)果表明U0126可顯著阻斷細(xì)胞周期進(jìn)程和Cyclin D1蛋白的表達(dá)水平。
　　 然后采用MTT法檢測(cè)B-Raf和Raf-1抑制劑預(yù)處理對(duì)細(xì)胞增殖無明顯影響。接下來，MTT和Western

7、blotting結(jié)果顯示PI3K抑制劑LY294002預(yù)處理可顯著抑制EAP引起的細(xì)胞增殖，且抑制了Akt和ERK磷酸化水平升高，提示PI3K也參與了EAP促進(jìn)NIH3T3細(xì)胞增殖的過程。
　　 綜上，推斷EAP促進(jìn)NIH3T3細(xì)胞增殖的作用機(jī)制為:EAP通過激活MEK/ERK信號(hào)通路，引起CyclinD1蛋白表達(dá)升高，促進(jìn)細(xì)胞周期從G1期進(jìn)入S期，最終引起細(xì)胞增殖，且PI3K信號(hào)通路可能是ERK的上游，通過PI3K→Rac→P