高遷移率族蛋白B-1對(duì)心臟成纖維細(xì)胞的作用及信號(hào)通路研究.pdf

1、前言:心肌重構(gòu)是多種心血管疾病的發(fā)生基礎(chǔ)，如高血壓、缺血性心肌病等，是心力衰竭發(fā)生發(fā)展的決定性過程。心肌重構(gòu)主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞肥大，間質(zhì)纖維化及電重構(gòu)過程。成年心臟中成纖維細(xì)胞的數(shù)目占60-70％，是細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的主要來源，ECM在心臟中起維持心臟結(jié)構(gòu)和功能完整的作用[1]。心臟成纖維細(xì)胞對(duì)損傷刺激反應(yīng)表現(xiàn)為多種方式，如增殖、遷移、分化為肌成纖維細(xì)胞，分泌細(xì)胞因子，以及基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)與組織金屬蛋白酶抑制劑(TIMP)表

2、達(dá)失衡[2]，這些反應(yīng)在初始階段對(duì)心肌功能恢復(fù)有利，但長期持續(xù)將導(dǎo)致纖維化[3]。心臟中ECM的合成降解是精密調(diào)控的過程。MMPs是依賴鋅的蛋白酶家族，能降解多種ECM蛋白，包括膠原，明膠，纖維連接蛋白及層粘連蛋白[4]?；A(chǔ)條件下，心臟成纖維細(xì)胞表達(dá)MMP-9的水平很低，但在炎癥因子刺激下顯著升高M(jìn)MP-9[2]。炎癥因子起初誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞聚集以利于心臟修復(fù)損傷，然而，若炎癥因子持續(xù)存在，他們將刺激纖維化，誘發(fā)心肌重構(gòu)[5]。目前研究

3、報(bào)道有多種炎癥因子能誘導(dǎo)MMP與TIMP失衡，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α），白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)，最終導(dǎo)致ECM紊亂[6，7]。炎癥因子在心血管疾病中的作用及其機(jī)制研究已得到越來越多的關(guān)注及重視?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，多種炎癥因子參與心肌重構(gòu)過程，但其在不同病因誘導(dǎo)的心肌重構(gòu)中發(fā)揮的作用不盡相同。高遷移率族蛋白B-1(HMGB1)是一種新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子，其廣泛表達(dá)于真核細(xì)胞的細(xì)胞核中，核內(nèi)的HMGB1作為DNA結(jié)合蛋白充當(dāng)結(jié)構(gòu)輔助因子

4、，維持恰當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。而細(xì)胞外的HMGB1由免疫細(xì)胞主動(dòng)分泌或壞死細(xì)胞被動(dòng)釋放[8]。目前報(bào)道細(xì)胞外的HMGB1參與多種病理過程，如炎癥，動(dòng)脈粥樣硬化，心肌缺血再灌注損傷（I/R）及心力衰竭等[9]。Andrassy[10]等人研究發(fā)現(xiàn)利用重組HMGB1干預(yù)小鼠會(huì)加重I/R，然而利用HMGB1 boxA干預(yù)后能顯著縮小梗死面積并能降低心臟損傷標(biāo)志物。而且研究報(bào)道HMGB1能促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大，誘導(dǎo)心肌肥厚，并能下調(diào)心臟瞬時(shí)外向鉀電流，誘導(dǎo)

5、心臟電重構(gòu)過程[11，12]。相反的是，近期研究提示HMGB1同時(shí)具有促進(jìn)組織修復(fù)和再生的作用[8]。然而，HMGB1在心肌重構(gòu)中的作用并未完全闡明，成纖維細(xì)胞在心肌重構(gòu)中具有重要作用。因此本研究擬通過體外培養(yǎng)細(xì)胞，觀察HMGB1對(duì)心臟成纖維細(xì)胞是否具有直接的生物學(xué)作用，并進(jìn)一步探討其相關(guān)機(jī)制，為心血管疾病提供潛在的治療靶點(diǎn)。本文主要從以下幾個(gè)方面進(jìn)行了論述:
　　第一部分 高遷移率族蛋白B-1對(duì)心臟成纖維細(xì)胞增殖、遷移、分化的影

6、響。
　　目的:觀察不同濃度(0，10，100，1000ng/ml)的高遷移率族蛋白B-1(HMGB1)對(duì)新生大鼠成纖維細(xì)胞增殖、遷移、分化的影響。
　　方法:利用新生SD大鼠(1-2天)分離、培養(yǎng)心臟成纖維細(xì)胞，予以不同濃度HMGB1(0，10，100，1000ng/ml)刺激24小時(shí)，采用CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力，Cell-IQ檢測(cè)細(xì)胞增殖，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)及transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力，Westernblot檢測(cè)α

7、-SMA蛋白，檢測(cè)對(duì)細(xì)胞分化的影響。
　　結(jié)果:CCK-8提示任何濃度的HMGB1(0，10，100，1000ng/ml)對(duì)心臟成纖維細(xì)胞沒有細(xì)胞毒作用。Cell-IQ提示HMGB1(0，10，100，1000ng/ml)干預(yù)24小時(shí)后，各組間成纖維細(xì)胞的數(shù)目相似。劃痕實(shí)驗(yàn)及transwell實(shí)驗(yàn)均提示10ng/ml濃度的HMGB1明顯促進(jìn)成纖維細(xì)胞遷移，而更高濃度的HMGB1(100，1000ng/ml)卻沒有促進(jìn)成纖維細(xì)胞遷移

8、的作用。蛋白免疫印跡(Western blot)檢測(cè)提示α-SMA蛋白在不同濃度的HMGB1(0，10，100，1000ng/rnl)組間表達(dá)無顯著差異。
　　結(jié)論:任何濃度的HMGB1(0，10，100，1000ng/ml)對(duì)新生大鼠心臟成纖維細(xì)胞刺激24小時(shí)后，無細(xì)胞毒作用，無促進(jìn)增殖作用及分化為肌成纖維細(xì)胞的作用。但是10ng/ml濃度的HMGB1明顯促進(jìn)成纖維細(xì)胞遷移，然而更高濃度的HMGB1(100，1000ng/ml)

9、卻沒有促進(jìn)成纖維細(xì)胞遷移的作用。
　　第二部分 高遷移率族蛋白B-1對(duì)心臟成纖維細(xì)胞MMP-9與TIMP-1表達(dá)的影響。
　　目的:觀察不同濃度(0，10，100，1000ng/ml)的高遷移率族蛋白B-1(HMGB1)對(duì)新生大鼠成纖維細(xì)胞MMP-9與TIMP-1表達(dá)的影響。
　　方法:利用新生SD大鼠(1-2天)分離、培養(yǎng)心臟成纖維細(xì)胞，予以不同濃度HMGB1(0，10，100，1000ng/ml)刺激24小時(shí)，提取

10、胞內(nèi)總蛋白，采用蛋白免疫印跡(Western blot)檢測(cè)胞內(nèi)MMP-9與TIMP-1蛋白表達(dá)水平;利用Millipore超濾管濃縮細(xì)胞上清，利用蛋白免疫印跡(Western blot)檢測(cè)細(xì)胞上清中MMP-9與TIMP-1蛋白水平。
　　結(jié)果:不同濃度的HMGB1(0，10，100，1000ng/ml)刺激新生大鼠心臟成纖維細(xì)胞24小時(shí)后，100ng/ml濃度的HMGB1干預(yù)組的細(xì)胞上清中MMP-9蛋白水平較對(duì)照組明顯升高(P

11、＜0.05)，然而更高濃度的HMGB1(1000ng/ml)刺激卻不能進(jìn)一步升高細(xì)胞上清中的MMP-9蛋白水平。同時(shí)，10ng/ml和100ng/ml濃度的HMGB1刺激均能升高細(xì)胞上清中的TIMP-1蛋白水平(P＜0.05)。此外，不同濃度的HMGB1(0，10，100，1000ng/ml)對(duì)成纖維細(xì)胞胞內(nèi)MMP-9及TIMP-1蛋白表達(dá)沒有顯著影響。
　　結(jié)論:HMGB1(10，100ng/ml)主要是通過上調(diào)胞外MMP-9及

12、TIMP-1蛋白誘導(dǎo)ECM紊亂的，然而對(duì)成纖維細(xì)胞胞內(nèi)MMP-9及TIMP-1蛋白表達(dá)沒有顯著影響。100ng/ml是HMGB1顯著刺激成纖維細(xì)胞表達(dá)MMP-9及TIMP-1蛋白的最佳濃度。
　　第三部分 高遷移率族蛋白B-1對(duì)心臟成纖維細(xì)胞作用受體及MAPKs通路的影響。
　　目的:觀察100ng/ml濃度的高遷移率族蛋白B-1(HMGB1)對(duì)新生大鼠成纖維細(xì)胞RAGE與TLR4受體表達(dá)的影響，并探討其對(duì)MAPKs的活化情

13、況。
　　方法:利用新生SD大鼠（1-2天）分離、培養(yǎng)心臟成纖維細(xì)胞，予以100ng/ml濃度的HMGB1刺激24小時(shí)，提取胞內(nèi)總蛋白，采用蛋白免疫印跡(Western blot)檢測(cè)RAGE與TLR蛋白表達(dá)水平。同時(shí)對(duì)成纖維細(xì)胞進(jìn)行HMGB1(100ng/ml)刺激0分鐘，5分鐘，10分鐘，30分鐘，采用蛋白免疫印跡(Western blot)檢測(cè)MAPKs(p-ERK1/2，p-JNK，p-P38)表達(dá)變化。
　　結(jié)果:

14、100ng/ml濃度的HMGB1干預(yù)心臟成纖維細(xì)胞24小時(shí)，TLR4表達(dá)較對(duì)照組升高(P口＜0.05），而RAGE表達(dá)與對(duì)照組相比無顯著差異。100ng/ml濃度的HMGB1刺激成纖維細(xì)胞不同時(shí)間(0，5，10，30min)，心臟成纖維細(xì)胞ERK1/2的磷酸化水平增加，且在5分鐘p-ERK1/2的表達(dá)水平達(dá)到高峰(P＜0.05);然而100ng/ml濃度的HMGB1干預(yù)成纖維細(xì)胞不同時(shí)間(0，5，10，30min)后并不能誘導(dǎo)JNK及P

15、38顯著活化。
　　結(jié)論:100ng/ml濃度的HMGB1能上調(diào)成纖維細(xì)胞TLR4受體表達(dá)，并能特異性地活化ERK1/2，提示HMGB1可能主要通過TLR4受體活化ERK1/2的。
　　第四部分 ERK1/2在高遷移率族蛋白B-1調(diào)節(jié)MMP-9及TIMP-1表達(dá)中的作用。
　　目的:觀察PD98059預(yù)先阻斷ERK1/2后，100ng/ml濃度的高遷移率族蛋白B-1(HMGB1)刺激新生大鼠成纖維細(xì)胞后對(duì)MMP-9及T

16、IMP-1表達(dá)的改變。
　　方法:利用新生SD大鼠(1-2天)分離、培養(yǎng)心臟成纖維細(xì)胞，預(yù)先予以12.5uM濃度的PD98059阻斷ERK1/2，2小時(shí)后再予100ng/ml濃度的高遷移率族蛋白B-1(HMGB1)干預(yù)成纖維細(xì)胞24小時(shí)，提取胞內(nèi)總蛋白，采用蛋白免疫印跡(Western blot)檢測(cè)胞內(nèi)MMP-9與TIMP-1蛋白表達(dá)變化;利用Millipore超濾管濃縮細(xì)胞上清，利用蛋白免疫印跡(Western blot)檢測(cè)