TRPM7對人胚肺成纖維細胞增殖及分化的調控機制研究.pdf

1、肺纖維化(pulmonaryfibrosis,PF)是一種嚴重的肺間質疾病,主要病理特點是早期的彌漫性肺泡炎,后期大量成纖維細胞病理性增殖轉型及細胞外基質(extracellularmatrix,ECM)進行性異常積聚并取代正常的肺組織結構[1]。肺纖維化發(fā)病受多種因素的共同影響,尤其是大量細胞因子的刺激作用,使成纖維細胞(FB)不斷地增殖和轉型為肌成纖維細胞(myofibroblast,MB)[2]。流行病學調查發(fā)現(xiàn),肺纖維化的發(fā)病率

2、、死亡率不斷上升,而且隨著年齡的增長,其發(fā)病率和死亡率也逐漸升高。目前,對PF的藥物治療主要以糖皮質激素和免疫抑制劑為主,但效果均不理想[3]。深入探討其發(fā)病機制,尋找新的藥物靶點,一直是國內外藥物研究的熱點。
　　瞬時受體電位通道(transientreceptorpotentialchannels,TRPchannel)是位于細胞膜上的一類重要的陽離子通道,瞬時受體電位通道7(TRPM7)是TRP家族成員之一,是一種具有陽離子

3、通道和蛋白激酶雙重結構的雙功能膜蛋白,可使自身或底物磷酸化,也被稱為“通道酶”[4,5]。文獻報道,TRPM7廣泛存在于機體組織中,參與細胞的生長、增殖、遷移、凋亡等多種生理病理過程[6,7],并在纖維化疾病的發(fā)病過程中具有重要作用[8,9]。但其在肺纖維化中的作用還未見文獻報道。
　　本實驗選用人胚肺成纖維細胞系MRC-5為研究對象,觀察TRPM7對MRC-5細胞增殖及分化的影響,并探討其可能的作用機制。主要研究內容概括如下:<

4、br>　　1.TRPM7在人胚肺成纖維細胞系MRC-5中的表達
　　本實驗通過TGF-β1刺激人胚肺成纖維細胞MRC-5,RT-PCR和Westernblot檢測MRC-5中TRPM7的表達情況。結果顯示,TGF-β1刺激組,TRPM7的表達明顯高于正常組。
　　2.抑制TRPM7表達對人胚肺成纖維細胞系MRC-5增殖及分化的影響
　　采用MTT比色法測定TRPM7非特異性阻斷劑Gd3+或2-APB對MRC-5的增殖抑

5、制率;流式細胞術檢測MRC-5周期變化;RT-PCR檢測TRPM7、α-SMA、Collagen?mRNA的表達變化;Westernblot檢測α-SMA、Collagen?蛋白的表達水平。結果顯示,Gd3+或2-APB能夠不同程度的降低MRC-5中TRPM7mRNA的表達,并且在一定范圍內抑制MRC-5的增殖。進一步研究TRPM7對MRC-5細胞周期的影響,結果發(fā)現(xiàn),TRPM7阻斷劑Gd3+或2-APB可通過促使細胞聚積于G0/G1期

6、,降低G2/M期及S期細胞,影響MRC-5細胞的增殖。同時,Gd3+或2-APB能夠降低MRC-5中α-SMA、Collagen?的mRNA和蛋白的表達,表明下調TRPM7的表達可抑制MRC-5的增殖和分化。
　　利用LipofectamineTM2000將特異性的TRPM7-siRNA轉染到MRC-5中,下調TRPM7在人胚肺成纖維細胞系MRC-5中的表達。分別運用流式細胞術檢測MRC-5細胞周期的影響;RT-PCR及Weste

7、rnblot法檢測TRPM7、α-SMA、Collagen?mRNA和蛋白的表達。結果提示,與對照組相比,TRPM7-siRNA轉染組細胞增殖受到抑制,肺纖維化標志性蛋白α-SMA、Collagen?的表達顯著下降。
　　3.TRPM7對人胚肺成纖維細胞系MRC-5中PI3K/AKT信號通路的影響
　　給予TGF-β1體外誘導肺纖維化模型,再分別給予PI3K/AKT通路特異性阻斷劑LY294002、離子通道阻斷劑Gd3+、2

8、-APB處理,MTT檢測細胞增殖抑制率,Westernblot法檢測p-Akt、t-Akt蛋白的表達。結果提示,與正常組比較,TGF-β1明顯促進MRC-5的增殖,而給予LY294002干預后,MRC-5的增殖明顯受到抑制,同時TGF-β1能顯著促進MRC-5p-Akt蛋白的表達,當使用LY294002、Gd3+、2-APB處理后,p-Akt蛋白表達均受到抑制,t-Akt蛋白表達無明顯變化,更進一步研究發(fā)現(xiàn),TRPM7-siRNA轉染組