siRNA沉默HMGA2對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)的影響.pdf

1、目的：運(yùn)用RNA干擾技術(shù)，在人胚肺成纖維細(xì)胞（MRC-5）中將肺纖維化相關(guān)基因HMGA2沉默，取矽肺患者肺泡巨噬細(xì)胞的上清培養(yǎng)液刺激MRC-5，觀察MRC-5細(xì)胞中I型和III型膠原的表達(dá)情況，探討HMGA2在矽肺纖維化發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用。
　　方法：
　　1、矽肺患者肺泡巨噬細(xì)胞（AM）的獲取：對(duì)II期矽肺患者進(jìn)行全麻下雙肺灌洗獲取肺泡灌洗液，經(jīng)過(guò)濾、離心、PBS洗滌等過(guò)程，之后做HE、抗酸及瑞氏染色鑒定該細(xì)胞，置于10

2、％FBS的DMEM培養(yǎng)基中繼續(xù)體外培養(yǎng)。2、SiO2刺激肺泡巨噬細(xì)胞（AM）上清液的獲?。涸跓o(wú)血清培養(yǎng)基DMEM中加入SiO2后繼續(xù)培養(yǎng)肺泡巨噬細(xì)胞。18h后收集培養(yǎng)上清液，過(guò)濾后冷凍保存。3、干擾載體的構(gòu)建：以pGPU6/GFP/Neo-shGAPDH為載體，經(jīng)上海吉瑪公司構(gòu)建HMGA2干擾載體及其對(duì)照載體。4、HMGA2干擾效率的檢測(cè)：干擾載體經(jīng)轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000介導(dǎo)分別轉(zhuǎn)入人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5內(nèi)，

3、轉(zhuǎn)染24h~48h后激光共聚焦顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率。提取細(xì)胞總mRNA和總蛋白，經(jīng)RT-PCR和Western-blot檢測(cè)出最佳干擾效率的載體用于后續(xù)試驗(yàn)。5、實(shí)驗(yàn)分為以下4組：空白對(duì)照組（C），含10%FBS的DMEM常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5；刺激組（S），使用經(jīng)SiO2粉塵刺激培養(yǎng)的AM上清液培養(yǎng)MRC-5；轉(zhuǎn)染組（T），將篩選的最佳干擾質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染MRC-5后，再加入經(jīng)SiO2粉塵刺激培養(yǎng)的AM培養(yǎng)上清液培養(yǎng)；陰性

4、轉(zhuǎn)染組（N），將陰性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MRC-5后，再加入經(jīng)SiO2粉塵刺激培養(yǎng)的AM培養(yǎng)上清液培養(yǎng)。6、I型和III型膠原蛋白表達(dá)的檢測(cè)：加SiO2刺激AM的培養(yǎng)上清液培養(yǎng)各組人胚肺成纖維細(xì)胞，在培養(yǎng)12h、24h、36h、48h和72h后，免疫細(xì)胞化學(xué)和Western-blot檢測(cè)其中I、III型膠原蛋白的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：1、LipofectamineTM2000∶脂質(zhì)體質(zhì)粒=2μg∶3μl轉(zhuǎn)染至人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5后24h

5、~48h，激光共聚焦顯微鏡觀察人胚肺成纖維細(xì)胞，結(jié)果顯示90%以上細(xì)胞中有綠色熒光蛋白的表達(dá)。2、用RT-PCR和Western blot法檢測(cè)轉(zhuǎn)染干擾載體后各組MRC-5細(xì)胞中HMGA2的表達(dá)，結(jié)果證實(shí)HMGA2的最佳干擾載體為pGPU6/GFP/Neo-HMGA2-homo-768；陰性轉(zhuǎn)染組（N）與空白對(duì)照組（C）差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3、免疫細(xì)胞化學(xué)法和Western blot法檢測(cè)結(jié)果均顯示：空白對(duì)照組MRC-5細(xì)胞中有I型和II

6、I型膠原蛋白的表達(dá)；刺激組（S）與空白對(duì)照組（C）細(xì)胞相比，I型和III型膠原蛋白表達(dá)均有上調(diào)（P＜0.05）；轉(zhuǎn)染組（T）與陰性轉(zhuǎn)染組（N）細(xì)胞相比，I型和III型膠原蛋白表達(dá)下調(diào)（P＜0.05）；陰性轉(zhuǎn)染組（N）與刺激組（S）相比，I型和III型膠原蛋白表達(dá)均無(wú)明顯差異（P＞0.05）,轉(zhuǎn)染組與刺激組相比I型和III型膠原蛋白的表達(dá)也有下調(diào)（P＜0.05）。
　　結(jié)論：1、經(jīng)RNA干擾技術(shù)將人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5中HMGA