人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞P物質(zhì)表達(dá)及其對(duì)膠原合成的影響.pdf

1、增生性瘢痕(hypertrophic scar，HS)是局限于皮膚傷區(qū)范圍之內(nèi)的纖維組織過度增生，常見于深Ⅱ度、Ⅲ度皮膚燒傷創(chuàng)面。成纖維細(xì)胞(fibroblast，F(xiàn)b)的異常增殖及膠原(collagen)合成增加和過度沉積是增生性瘢痕的病理特征。目前對(duì)其發(fā)病機(jī)制仍不清楚，一般認(rèn)為膠原合成的主要細(xì)胞一成纖維細(xì)胞的功能異常與其自分泌的某些因子、蛋白關(guān)系密切。如由增生性瘢痕成纖維細(xì)胞自分泌的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-α、β(transforminggr

2、owth factor-α、β,FGF-α、β)、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白(IGF-binding proteins,IGFBPs)的調(diào)控模式不同于正常皮膚，由此影響了增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的膠原合成。 P物質(zhì)(substance P，SP)是目前發(fā)現(xiàn)最早、功能復(fù)雜的神經(jīng)肽，它不僅存在于中樞、外周神經(jīng)系統(tǒng)，成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞(單核/巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞)等不僅有P物質(zhì)受體，還可合成、分泌P物質(zhì)。成纖維細(xì)胞自分泌SP受胞外

3、SP的調(diào)控。如以大劑量辣椒素耗竭感覺神經(jīng)末梢，阻斷神經(jīng)末梢釋放SP后，致傷鼠皮膚傷區(qū)肉芽組織成纖維細(xì)胞SP表達(dá)較未用辣椒素致傷鼠明顯減弱；10<'-8>mol/LSP加入正常皮膚成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)液后1-3h，成纖維細(xì)胞的SP基因和蛋白表達(dá)迅速上調(diào)。近來的研究證實(shí)，SP是組織修復(fù)的重要調(diào)控因子。皮膚損傷時(shí)感覺神經(jīng)末梢釋放的SP不僅可啟動(dòng)神經(jīng)源性炎性反應(yīng)，同時(shí)可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞內(nèi)多種細(xì)胞因子(如TGF-β、EGF、TNF)表達(dá)增多，直接或間接

4、促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖。 已知增生性瘢痕組織中SP含量明顯較正常皮膚組織高，但目前尚不明確增生性瘢痕成纖維細(xì)胞(hypertrophic scar fibroblast，HSF)SP表達(dá)水平與正常皮膚成纖維細(xì)胞(normal skin fibroblast，NSF)相比有何特點(diǎn)，細(xì)胞外SP對(duì)其表達(dá)有何影響，SP在增生性瘢痕膠原合成中有何作用?針對(duì)上述問題開展研究，無疑將豐富增生性瘢痕成纖維細(xì)胞異質(zhì)性理論，同時(shí)可以為增生性瘢痕治療提供

5、新的思路。 為探討增生性瘢痕成纖維細(xì)胞SP表達(dá)的特點(diǎn)及其對(duì)膠原合成的影響，本研究采用體外培養(yǎng)的人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞為對(duì)象，以培養(yǎng)的正常皮膚成纖維細(xì)胞為對(duì)照，利用RT-PCR和酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)(ELIsA)技術(shù)，分別從mRNA和蛋白兩個(gè)水平檢測(cè)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞SP的表達(dá)。在此基礎(chǔ)上，分別用10<'-7>mol/L(低濃度)和10<'-5>mol/L(高濃度)SP以模擬不同胞外SP濃度刺激培養(yǎng)的增生性瘢痕和正常皮膚成纖維細(xì)胞，

6、觀察兩種成纖維細(xì)胞SP表達(dá)的時(shí)效特點(diǎn)，以此分析細(xì)胞外SP對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞SP表達(dá)的影響。為了解成纖維細(xì)胞自分泌SP在膠原合成中的作用，以SP受體阻斷劑(WIN62577)特異阻斷培養(yǎng)的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞及正常皮膚成纖維細(xì)胞SP受體NK-1R(Neurokinin 1 receptor)后，采用放射示蹤法檢測(cè)3H一脯氨酸摻入及免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)合圖像分析技術(shù)，分析NK-1R阻斷后成纖維細(xì)胞膠原合成的變化。 結(jié)果如下：

7、 1、體外培養(yǎng)的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的鑒定及SP表達(dá)情況 (1)體外培養(yǎng)的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，波形蛋白(+)，α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(一)，確定為實(shí)驗(yàn)所需的成纖維細(xì)胞。 (2)體外培養(yǎng)的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞內(nèi)SP mRNA表達(dá)明顯高于正常皮膚成纖維細(xì)胞，其SP蛋白表達(dá)量為0.132±0.026nmol/L，而正常皮膚成纖維細(xì)胞SP蛋白表達(dá)量為0.056±0.022nmol/l，兩者之間差異顯著(P<0.05)。

8、 2、外源性SP對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞SP表達(dá)的影響 采用不同濃度的SP刺激體外培養(yǎng)的增生性瘢痕和正常皮膚成纖維細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞SP mRNA和蛋白表達(dá)均明顯上調(diào)，但增生性瘢痕成纖維細(xì)胞在達(dá)到峰值的時(shí)相、升高的幅度、峰值均明顯不同于正常皮膚。 (1)成纖維細(xì)胞SP mRNA表達(dá)10<'-7>mol/LSP刺激后，增生性瘢痕和正常皮膚成纖維細(xì)胞SP mRNA表達(dá)受SP刺激后均出現(xiàn)上調(diào)，分別在刺激后6h、3h達(dá)到

9、高峰，隨后緩慢下降。10<'-5>mol/LSP刺激后，增生性瘢痕和正常皮膚成纖維細(xì)胞內(nèi)SP mRNA在刺激后3h、6h達(dá)到高峰，增生性瘢痕成纖維細(xì)胞峰值高于正常皮膚。兩種濃度刺激后24h增生性瘢痕成纖維細(xì)胞SP mRNA均高于正常皮膚成纖維細(xì)胞。 (2)成纖維細(xì)胞SP蛋白表達(dá)10<'-7>mol/L SP刺激后，增生性瘢痕成纖維細(xì)胞SP蛋白表達(dá)在刺激后6h達(dá)到高峰，達(dá)到0.367±0.026nmol/L，升高了225％，隨后緩

10、慢下降，刺激后24h為0.224±0.014nmol/L，仍高于未刺激瘢痕成纖維細(xì)胞，兩組相差非常顯著(P<0.01)。正常皮膚成纖維細(xì)胞SP蛋白表達(dá)在刺激后3h達(dá)到高峰，達(dá)到0.489±0.022nmol/L，升高了823％，刺激后24h為0.163±0.015 nmol/L，高于未刺激正常皮膚成纖維細(xì)胞(P<0.01)。10<'-5>mol/L SP刺激后，增生性瘢痕成纖維細(xì)胞SP蛋白在刺激后3h達(dá)到高峰，達(dá)到1.476±0.06

11、8nmol/L，較刺激前升高了834％，隨后迅速下降，刺激后24h為0.248±0.031 nmol/L，仍高于未刺激瘢痕成纖維細(xì)胞(P<0.01)。10<'-5>mol/LSP刺激后，正常皮膚成纖維細(xì)胞SP蛋白在刺激后6h達(dá)到高峰，達(dá)到1.257±0.086nmol/L，升高了1805％，刺激后24h為0.196±0.024 nmol/L，高于未刺激正常皮膚成纖維細(xì)胞(P<0.01)。 (3)與正常皮膚成纖維細(xì)胞相比，10<'

12、-7>mol/L或10<'-5>mol/L SP刺激下增生性瘢痕成纖維細(xì)胞SP mRNA和蛋白表達(dá)的峰值、達(dá)到峰值時(shí)相均有明顯差異(P<0.05或P<0.01)，且刺激后24h增生性瘢痕成纖維細(xì)胞SP表達(dá)水平均高于正常皮膚成纖維細(xì)胞。 3、SP對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞膠原合成的影響。 (1)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞<'3>H-脯氨酸摻入閃爍點(diǎn)計(jì)數(shù)為82.13±9.23 cpm/1000細(xì)胞，顯著高于正常皮膚成纖維細(xì)胞(35.7

13、±9.8 cpm/1000細(xì)胞)(P<0.01)。 加入NK-1R阻斷劑后，增生性瘢痕成纖維細(xì)胞<'3>H-脯氨酸摻入閃爍點(diǎn)計(jì)數(shù)為36.75±5.83cpm/1000細(xì)胞，明顯低于未阻斷的對(duì)照組，阻斷率達(dá)到55.25％，組間差異非常顯著(P<0.01)。正常皮膚成纖維細(xì)胞NK-1R阻斷后，<'3>H-脯氨酸摻入閃爍點(diǎn)計(jì)數(shù)為24.48±3.48cpm/1000細(xì)胞，低于未阻斷的對(duì)照組(35.7±9.8 cpm/1000細(xì)胞)，阻斷

14、率為31.43％，組間差異非常顯著(P<0.01)。 (2)加入NK-1R阻斷劑后，免疫組化半定量分析結(jié)果示，Ⅰ型前膠原的平均灰度值為102.18±15.26，Ⅲ型前膠原的平均灰度值為111.53±14.79，均明顯低于未阻斷對(duì)照組(P<0.01)，阻斷率分別為33.35％、21.67％。 結(jié)論： 1、增生性瘢痕成纖維細(xì)胞SPmRNA和蛋白表達(dá)均明顯高于正常皮膚成纖維細(xì)胞，這可能是增生性瘢痕組織中SP含量高的原因

15、之一。 2、外源性SP對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞P物質(zhì)表達(dá)的影響不同于正常皮膚成纖維細(xì)胞。10<'-7>mol/L 或10<'-5>mol/L SP作用于增生性瘢痕成纖維細(xì)胞，其SP基因、蛋白表達(dá)升高時(shí)相點(diǎn)、峰值均與正常皮膚成纖維細(xì)胞有顯著差異，且刺激后24h增生性瘢痕成纖維細(xì)胞SP表達(dá)水平均高于正常皮膚成纖維細(xì)胞。表明增生性瘢痕成纖維細(xì)胞功能異質(zhì)性明顯，其SP基因、蛋白表達(dá)與正常皮膚成纖維細(xì)胞有明顯差異。SP自分泌的"調(diào)控平衡點(diǎn)"