細胞缺氧損傷中TRPM7介導(dǎo)的凋亡機制及NGF對TRPM7調(diào)節(jié)機制研究.pdf

1、本研究分為二部分：
　　 第一部分：TRPM7介入氧糖剝奪/再氧合誘導(dǎo)細胞凋亡的機制研究
　　 第一節(jié)：建立四環(huán)素調(diào)控性穩(wěn)定表達全長、缺激酶區(qū)TRPM7的HEK293細胞系
　　 TRPM7（transient receptor potential melastatin 7），也稱ChaK1（Channel-Kinase1），是一種獨特的、既有非選擇性陽離子通道又有蛋白激酶活性的雙功能蛋白。本部分實驗主要是建立四

2、環(huán)素調(diào)控性穩(wěn)定表達全長、缺激酶區(qū)TRPM7的HEK293細胞系，為進一步在細胞水平研究TRPM7 及其激酶功能提供實驗基礎(chǔ)。
　　 采用陽離子脂質(zhì)體法將含小鼠TRPM7 cDNA的真核表達質(zhì)粒pcDNA5/FRT/TO-HA-TRPM7/WT（表達全長TRPM7（TRPM7/WT））和pcDNA5/FRT/TO-HA-TRPM7/△Kin（表達缺激酶區(qū)TRPM7（TRPM7/△Kin））分別與Flp 重組酶表達質(zhì)粒pOG44 共

3、同轉(zhuǎn)入Flp-In TM T-Rex TM 293細胞，經(jīng)過潮霉素篩選，收集抗藥細胞克隆建立細胞系，分別命名為293-TRPM7/WT（轉(zhuǎn)染pcDNA5/FRT/TO-HA-TRPM7/WT）和293-TRPM7/△Kin（轉(zhuǎn)染pcDNA5/FRT/TO-HA-TRPM7/△Kin）。采用免疫印跡和免疫熒光技術(shù)對細胞進行鑒定，結(jié)果顯示：293-TRPM7/WT和293-TRPM7/△Kin細胞均在四環(huán)素誘導(dǎo)后才表達TRPM7 蛋白（前者

4、表達TRPM7/WT，后者表達TRPM7/△Kin），且TRPM7 蛋白表達水平均呈四環(huán)素濃度依賴性。綜上所述，我們成功建立了四環(huán)素調(diào)控性穩(wěn)定表達全長、缺激酶區(qū)TRPM7的HEK293細胞系。
　　 第二節(jié)：TRPM7激酶區(qū)在氧糖剝奪/再氧合誘導(dǎo)細胞凋亡中的作用，及其與Annexin-1之間的關(guān)系
　　 腦缺血后的神經(jīng)元損傷是造成神經(jīng)功能缺損的主要原因。最近的研究顯示，TRPM7 通道的活動與缺氧神經(jīng)元的死亡密切相關(guān)，但

5、是TRPM7 激酶在缺血缺氧神經(jīng)元損傷過程中作用尚未見報導(dǎo)。
　　 本部分實驗利用四環(huán)素調(diào)控性穩(wěn)定表達全長和缺激酶區(qū)TRPM7的293-TRPM7/WT和293-TRPM7/△Kin細胞系，通過建立氧糖剝奪/再氧合（oxygen-glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R）離體模型，即細胞在無糖無氧的環(huán)境中孵育1h（氧糖剝奪）后恢復(fù)正常培養(yǎng)一定時間（再氧合），模擬在體缺血再灌注過程，從細胞水平

6、初步探討TRPM7 激酶區(qū)在OGD/R 引起的細胞損傷和細胞凋亡中的作用及其可能的機制。Annexin-1 是TRPM7 激酶區(qū)重要的底物蛋白，本研究通過觀察Annexin-1的變化來討論TRPM7 激酶區(qū)的作用機制。
　　 實驗采用MTT法檢測細胞活性，Annexin V-FITC、PI 雙染法結(jié)合流式細胞術(shù)檢測、分析細胞凋亡率，應(yīng)用免疫熒光和免疫印跡技術(shù)檢測TRPM7、Annexin-1 蛋白的分布和表達，利用免疫共沉淀法分

7、析TRPM7與Annexin-1的相互作用。
　　 結(jié)果顯示：
　　 1、TRPM7 激酶區(qū)參與TRPM7 促進OGD/R細胞損傷和細胞凋亡。
　　 2、OGD/R 過程中，TRPM7 通過其激酶區(qū)增強與Annexin-1結(jié)合。
　　 3、OGD/R誘導(dǎo)HEK293細胞出現(xiàn)TRPM7 激酶區(qū)依賴的Annexin-1 蛋白水平增加和Annexin-1細胞核、細胞膜轉(zhuǎn)位。
　　 4、Annexin-1

8、 參與TRPM7介導(dǎo)的OGD/R細胞損傷和細胞凋亡。
　　 綜上所述，本實驗首次驗證了：在OGD/R 過程中，TRPM7 通過其激酶區(qū)上調(diào)Annexin-1的蛋白水平，促進Annexin-1轉(zhuǎn)位到細胞核和細胞膜，從而加劇OGD/R誘導(dǎo)細胞損傷和細胞凋亡。本研究的發(fā)現(xiàn)為進一步研究TRPM7 激酶介導(dǎo)腦缺血再灌注神經(jīng)元凋亡提供了實驗依據(jù)。
　　 第二部分：NGF抑制Gd 3+敏感性鈣內(nèi)流，減少化學(xué)缺氧神經(jīng)元死亡
　　

9、 本部分實驗主要探討急性缺氧神經(jīng)元損傷過程中是否存在非谷氨酸受體通道和非電壓門控鈣通道依賴性的鈣內(nèi)流，及其與NGF 神經(jīng)元保護作用之間的關(guān)系。
　　 以KCN作為誘導(dǎo)劑，在體外培養(yǎng)的新生大鼠海馬神經(jīng)元上建立急性缺氧的細胞模型，應(yīng)用激光掃描共聚焦顯微鏡監(jiān)測細胞內(nèi)鈣離子濃度變化，利用cFDA與PI 染色法評價細胞的存活和死亡率。
　　 結(jié)果顯示：
　　 1、給予原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元KCN（3mM）處理15min后，細

10、胞內(nèi)鈣離子濃度（[Ca2+]I）顯著升高至缺氧前6.27±0.05 倍（P<0.05），73.3%±12.1%細胞死亡（P<0.05）。
　　 2、20μM MK-801（NMDA 受體拮抗劑）、40μM CNQX（AMPA 受體拮抗劑）和5μM Nimodipine（電壓門控鈣通道拮抗劑）聯(lián)用（簡稱MCN）顯著降低KCN 引起的[Ca2+]I 升高和細胞死亡率（P<0.05），但[Ca2+]I 為缺氧前4.02±0.04 倍，

11、仍有38.5%±4.4%細胞死亡，均顯著高于正常（P<0.05）。
　　 3、Gd 3+（10μM）與MCN 聯(lián)用后幾乎完全阻斷KCN 引起的[Ca2+]I 升高，并進一步降低細胞死亡率。[Ca2+]I 僅為缺氧前1.2±0.03 倍，與正常相比差異無顯著性，神經(jīng)元死亡率降至8.2%±1.5%。
　　 4、與Gd 3+的作用相似，NGF（100ng/ml）與MCN 聯(lián)用后顯著減弱KCN 引起的[Ca2+]I 升高，[Ca