離子通道TRPM7調(diào)節(jié)細(xì)胞生理的分子機(jī)制研究.pdf

1、心腦血管疾病已然成為引起人類死亡的首要原因，深入了解心腦血管疾病的發(fā)病機(jī)制，開(kāi)發(fā)有效的治療藥物已經(jīng)迫不及待。離子通道在心腦血管疾病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用。最近，短暫性受體電位（TRP）離子通道在心腦血管系統(tǒng)生理病理中的作用引起了人們的廣泛關(guān)注。至今發(fā)現(xiàn)的30多種TRP通道絕大多數(shù)表達(dá)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，其中至少有19種也在內(nèi)皮細(xì)胞中所有表達(dá)。TRPM7作為TRP通道m(xù)elastatin家族的第7號(hào)成員，因?yàn)榻Y(jié)構(gòu)特殊、表達(dá)廣泛、功能眾多而

2、受到關(guān)注。首先，TRPM7除了具有離子通道結(jié)構(gòu)域，在其C末端含有一個(gè)激酶結(jié)構(gòu)域，又被稱為通道酶。TRPM7的活性受到多種因素的調(diào)節(jié)包括自身蛋白的磷酸化、胞內(nèi)的磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸(PIP2)、pH值、氧化應(yīng)激、機(jī)械應(yīng)力、血管活性物質(zhì)等，暗示其生物功能的多樣性。其次，TRPM7廣泛分布于各種組織和器官，包括心臟、大腦、肺、肝臟、血管等等。再次，TRPM7調(diào)節(jié)各種各樣的生理病理過(guò)程，例如調(diào)節(jié)細(xì)胞的增值、遷移、粘附、凋亡、炎癥反應(yīng)、離子

3、平衡等。越來(lái)越多的證據(jù)顯示TRPM7在腦組織和心血管系統(tǒng)的生理病理過(guò)程中發(fā)揮了非常重要的調(diào)節(jié)作用，參與調(diào)節(jié)腦卒中、高血壓、心房顫動(dòng)、心臟的早期發(fā)育、血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖遷移、平滑肌細(xì)胞的增殖和鎂離子穩(wěn)態(tài)等。例如，腦缺血或氧糖剝奪(OGD)產(chǎn)生的超氧陰離子可以激活TRPM7，導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞的鈣離子內(nèi)流增加，增加神經(jīng)元細(xì)胞的損傷，而抑制TRPM7的活性或干擾其表達(dá)都能顯著抑制神經(jīng)元細(xì)胞的鈣離子內(nèi)流和損傷。血管內(nèi)皮細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞分別作為心血

4、管系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的組成部分，發(fā)揮了重要的生理和病理功能。血管內(nèi)皮細(xì)胞是指血管內(nèi)膜表面的一層細(xì)胞，主要參與血管的收縮和舒張、凝血、動(dòng)脈硬化、血管生成以及炎癥等生理病理過(guò)程。之前的研究發(fā)現(xiàn)，干擾TRPM7在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)增加了細(xì)胞的增殖和遷移，保護(hù)了高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮損傷。暗示TRPM7在血管內(nèi)皮中扮演重要角色。而星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的數(shù)量最多的細(xì)胞，是神經(jīng)元細(xì)胞的6-10倍。星形膠質(zhì)細(xì)胞的偽足既可以延伸入到神經(jīng)細(xì)胞

5、周圍，發(fā)揮其支持和滋養(yǎng)神經(jīng)元、分泌和吸收神經(jīng)遞質(zhì)、調(diào)節(jié)離子平衡以及參與免疫反應(yīng)等作用，又可以附著在鄰近的毛細(xì)血管壁上，調(diào)節(jié)血管張力和血腦屏障。TRPM7在大腦中的表達(dá)較高，又參與了腦缺血誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷，但在星形膠質(zhì)細(xì)胞中的作用還不是很清楚，所以本項(xiàng)目通過(guò)研究TRPM7調(diào)節(jié)細(xì)胞生理的分子機(jī)制來(lái)完成以下幾個(gè)目的。
　　目的：①以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)為血管內(nèi)皮模型，通過(guò)研究TRPM7對(duì)的血管內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)、粘附、遷移、體外血

6、管新生等生理過(guò)程的影響及其分子機(jī)制來(lái)探討TRPM7對(duì)血管內(nèi)皮功能調(diào)節(jié)作用，為TRPM7作為治療心腦血管疾病藥物靶點(diǎn)的提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。②通過(guò)研究功能性的離子通道TRPM7在星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)、對(duì)細(xì)胞增殖和遷移的影響及其分子機(jī)制，探討TRPM7對(duì)大腦膠質(zhì)細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)，為治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的提供潛在的新藥物靶點(diǎn)。
　　方法：⑴利用小干擾RNA(siRNA)特異性地干擾HUVEC中TRPM7通道m(xù)RNA和蛋白的表達(dá)，通過(guò)實(shí)時(shí)定量

7、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real time-PCR，qPCR)和電生理的方法來(lái)驗(yàn)證siRNA的干擾效率。⑵觀察和定量分析干擾TRPM7表達(dá)后HUVEC的形態(tài)變化及其對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)(matrigel)的粘附能力的變化。⑶利用遷移小室(transwell)和劃痕實(shí)驗(yàn)研究干擾TRPM7表達(dá)后HUVEC與正常對(duì)照細(xì)胞間遷移能力變化。⑷通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞在matrigel上形成血管樣結(jié)構(gòu)來(lái)分析干擾TRPM7表達(dá)之后對(duì)HUVEC體外血管生

8、成的影響。⑸通過(guò)免疫蛋白印跡或者qPCR的方法研究干擾TRPM7表達(dá)后的HUVEC的 MEK1/2和肌球蛋白輕鏈(MLC)分子的磷酸化水平，以及其他鈣離子調(diào)節(jié)相關(guān)基因如Orai1、Stim1、TRPC3和TRPC1的表達(dá)。⑹利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)、免疫蛋白印跡和電生理的方法檢測(cè)功能性TRPM7通道在星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)。⑺利用特異性的siRNA降低TRPM7在星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)，然后通過(guò)RT-PCR，qPCR、免疫蛋

9、白印跡和電生理的方法來(lái)驗(yàn)證siRNA的干擾效率以及TRPM7通道功能的抑制。⑻通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)乳酸脫氫酶(LDH)含量和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)分別來(lái)研究TRPM7在星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖和遷移中的作用。⑼利用免疫蛋白印跡方法，研究TRPM7調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖和遷移過(guò)程的分子機(jī)制。⑽利用鎂離子濃度試劑盒和流式細(xì)胞術(shù)研究TRPM7對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子和鎂離子濃度的影響。⑾通過(guò)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)研究胞外的鈣、鎂離子對(duì)TRPM7調(diào)節(jié)的星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖的影響。

10、>　　結(jié)果：⑴qPCR的結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染TRPM7 siRNA-1和siRNA-272小時(shí)后HUVEC的TRPM7 mRNA的表達(dá)水平分別下降到了～39.67％和～29.49％。電生理實(shí)驗(yàn)全細(xì)胞膜片鉗的結(jié)果也顯示HUVEC細(xì)胞膜上的TRPM7樣的電流密度也顯著性地降低了，當(dāng)細(xì)胞膜的電壓鉗制在-80 mv時(shí)TRPM7電流密度下降了～63.8％，當(dāng)鉗制在+80 mv時(shí)下降了～45.5％。同時(shí)，對(duì)HUVEC胞內(nèi)鎂離子檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，干擾

11、TRPM7后鎂離子濃度顯著下降～10％。提示siRNA有效的干擾了HUVEC中TRPM7的表達(dá)和功能。⑵干擾TRPM7表達(dá)后HUVEC的形態(tài)發(fā)生明顯變化（從扁平多角形狀變成細(xì)長(zhǎng)狀）。對(duì)單細(xì)胞平均表面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示干擾TRPM7后單細(xì)胞的平均表面積降低了～50％。隨后粘附實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HUVEC對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的粘附能力也顯著下降了～45.67％。⑶Tranwell實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，干擾TRPM7表達(dá)后的HUVEC，與對(duì)照組

12、相比，遷移能力和損傷修復(fù)能力分別增加了～300％和～56.64％，而且HUVEC早期（4小時(shí)）體外血管生成能力也增加了～39.5％。⑷分子機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，干擾TRPM7表達(dá)后，HUVEC的MEK和MLC的磷酸化水平明顯增加，而使用MEK的特異性抑制劑U0126后，干擾TRPM7誘導(dǎo)的MLC磷酸化水平與對(duì)照組沒(méi)有差異。同時(shí)，U0126也能夠顯著性的抑制TRPM7調(diào)節(jié)的HUVEC的形態(tài)變化以及細(xì)胞遷移增加。提示TRPM7調(diào)節(jié)HUVEC的生理過(guò)

13、程可能是通過(guò)MEK/ERK/MLC信號(hào)通路。⑸qPCR和免疫蛋白印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染TRPM7 siRNA后并不影響HUVEC的TRPC3、Orai1、Stim1基因的表達(dá)，但顯著性地上調(diào)了TRPC1的mRNA和蛋白表達(dá)。⑹體外成功分離和培養(yǎng)了小鼠大腦皮層原代星形膠質(zhì)細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)鑒定純度高達(dá)95％以上。⑺RT-PCR和細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)TRPM7的mRNA和蛋白。同時(shí)，利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)檢測(cè)到星形膠

14、質(zhì)細(xì)胞膜表面表達(dá)TRPM7樣的電流。⑻轉(zhuǎn)染TRPM7 siRNA-1和siRNA-2都能夠顯著性地降低星形膠質(zhì)細(xì)胞中的TRPM7 mRNA和蛋白的表達(dá)，而不影響TRPM4和TRPM6的mRNA表達(dá)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)顯示TRPM7 siRNA-1能顯著性地降低TRPM7的mRNA表達(dá)和電流密度。⑼干擾TRPM7的表達(dá)或抑制TRPM7的活性導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖和遷移能力顯著下降。免疫蛋白印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，干擾TRPM7的表達(dá)導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞MA

15、PK信號(hào)通路中的ERK1/2和JNK分子的磷酸化水平分別下降了～24.37％和～36.64％，而p38和Akt的磷酸化水平?jīng)]有變化。同時(shí)，TRPM7的抑制劑2-APB也抑制了星形膠質(zhì)細(xì)胞ERK和JNK的磷酸化水平。⑽MEK和JNK信號(hào)通路的選擇性抑制劑U0126和SP600125分別都顯著性地抑制了星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖和遷移。暗示TRPM7調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖和遷移是通過(guò)ERK和JNK信號(hào)通路。⑾在四環(huán)素誘導(dǎo)的過(guò)表達(dá)TRPM7的HEK29

16、3細(xì)胞中胞內(nèi)的鎂離子濃度顯著增加了～73.2％，而干擾TRPM7表達(dá)后星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的鎂離子濃度顯著下降了～43.5％，但流式細(xì)胞術(shù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示鈣離子水平并沒(méi)有受到影響。但是細(xì)胞外添加鎂離子并不能挽救干擾TRPM7表達(dá)導(dǎo)致的細(xì)胞增殖抑制。
　　結(jié)論：①TRPM7在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中總體上呈現(xiàn)出一種負(fù)調(diào)控作用，特異性的干擾TRPM7表達(dá)改變了細(xì)胞的形態(tài)，促進(jìn)細(xì)胞的遷移和早期血管生成，上調(diào)TRPC1的表達(dá)，有利于保護(hù)內(nèi)皮的部分功能，

17、這一過(guò)程可能受到MEK/ERK/MLC信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。TRPM7可能成為一個(gè)新的調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞生理功能的藥物靶點(diǎn)。②星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)功能性的TRPM7通道，干擾TRPM7表達(dá)或抑制其活性損傷ERK和JNK信號(hào)通路的活化，抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖和遷移。雖然TRPM7可以調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的鎂離子濃度，但細(xì)胞外添加鎂離子并不影響星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖，也無(wú)法挽救干擾TRPM7導(dǎo)致的細(xì)胞增殖抑制。TRPM7可能成為一個(gè)新的調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞的生理功能