TRPM7通道調(diào)節(jié)3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖和分化.pdf

1、研究背景：Transient receptor potential melastatin7(TRPM7)廣泛表達(dá)于多種組織和細(xì)胞,并且參與了很多重要的生理和病理過程。3T3-L1前脂肪細(xì)胞是用來研究代謝性疾病的重要細(xì)胞模型,然而,TRPM7通道在3T3-L1前脂肪細(xì)胞的表達(dá)和功能尚未見報(bào)道。本研究旨在探討TRPM7通道在3T3-L1前脂肪細(xì)胞的表達(dá)情況以及是否參與了細(xì)胞增殖和分化調(diào)節(jié)。方法：采用的方法包括:RT-PCR,全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)

2、,Western Blotting,MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖,成脂誘導(dǎo)分化等。結(jié)果：我們發(fā)現(xiàn),用無鎂的電極內(nèi)液在3T3-L1細(xì)胞上記錄到一種TRPM7樣電流。該電流的內(nèi)向部分較外向部分小(-120 mV vs+100 mV:-13.1±1.3 pA/pF vs71.2±3.2 pA/pF,n=25),外向部分呈現(xiàn)明顯的整流特性。當(dāng)去除細(xì)胞外液二價(jià)陽離子時(shí),該電流明顯增大(在-120 mV:-62.5±7.0 pA/pF vs-13.1±1.

3、3 pA/pF;在+100 mV:136.0±12.7 pA/pF vs71.2±3.2 pA/pF,n=18),且外向電流比內(nèi)向電流對(duì)無二價(jià)陽離子的外液反應(yīng)快。2-APB和精胺(spermine),以及電極內(nèi)液中的游離鎂離子均可濃度依賴性的抑制該電流,其中2-APB的IC50為15.6μM,游離鎂離子的IC50為297.3μM。在去除細(xì)胞外液中的鈣鎂離子后,降低pH(從7.3到4.0)引起內(nèi)外向電流明顯減小。RT-PCR結(jié)果提示:3T

4、3-L1前脂肪細(xì)胞存在有多種TRP mRNA,包括TRPC1、TRPC2、TRPM4、TRPM6、TRPM7、TRPV2、TRPV3、TRPV4、TRPP2,Western Blotting也檢測(cè)到了TRPM7通道蛋白的表達(dá)。MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖結(jié)果表明,TRPM7通道阻斷劑2-APB和精胺均可濃度依賴性的抑制3T3-L1細(xì)胞的增殖,2-APB(200μM)和精胺(10μM)對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率分別為71.7±1.5％和50.2±0.7％

5、(P<0.01 vs control),在給予10 mM的Mg2+后能顯著地減弱精胺對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用。使用特異性的RNA干擾序列將TRPM7基因沉默,可明顯抑制細(xì)胞增殖,最大抑制率為15.8±5.1％。采用“雞尾酒”法誘導(dǎo)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化,經(jīng)過TRPM7-siRNA處理的細(xì)胞誘導(dǎo)分化后甘油三酯的合成明顯減少,與陰性對(duì)照組相比,最大能減少25.4±1.8％。結(jié)論：①我們首次發(fā)現(xiàn)多種TRP通道在3T3-L1前脂肪細(xì)胞表達(dá),②T