晚期氧化蛋白產(chǎn)物抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化.pdf

1、脂肪組織為體內(nèi)的代謝器官，在人體的能量代謝中發(fā)揮著重要的作用。過去人們一直認(rèn)為它的主要功能是被動(dòng)的作為體內(nèi)多余脂肪的儲(chǔ)存?zhèn)}庫，而現(xiàn)在則認(rèn)為它在代謝調(diào)節(jié)、攝食行為及免疫調(diào)節(jié)等多項(xiàng)生理活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用，并可分泌多種脂肪細(xì)胞因子（包括多種炎癥因子）。與其他組織不同的是，脂肪組織具有巨大的膨脹能力：一是通過前脂肪細(xì)胞的增殖分化，轉(zhuǎn)變?yōu)橛泄δ艿闹炯?xì)胞，即成脂作用；二是通過脂肪細(xì)胞體積的增大，即肥大。 前脂肪細(xì)胞分化受一系列基因調(diào)控，

2、這些基因的活性在時(shí)空上存在相互調(diào)節(jié)。過氧化物酶增殖物活化受體（PPAR）和CCAAT/增強(qiáng)子連接蛋白（C/EBP）家族是兩類重要的脂肪細(xì)胞分化的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。C/EBP家族成員是第一個(gè)被證明在脂肪細(xì)胞分化過程中起重要作用的轉(zhuǎn)錄因子，這些轉(zhuǎn)錄因子有一個(gè)堿性轉(zhuǎn)錄激活區(qū)和一個(gè)亮氨酸拉鏈體，可形成同源或異源二聚體，通過DNA結(jié)合區(qū)結(jié)合于靶基因的調(diào)控元件。在前脂肪細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑的作用下，首先是C/EBP δ和C/EBP β的表達(dá)短暫而快速的升高，

3、二者再激活PPAR γ和C/EBPα的基因表達(dá)，隨后即有大量的脂肪細(xì)胞分化的特異基因開始表達(dá)，如脂肪酸結(jié)合蛋白AP2，這些基因的表達(dá)是脂肪細(xì)胞成熟的標(biāo)志。C/EBP β主要有三種亞型，即兩個(gè)轉(zhuǎn)錄活化因子LAP，一個(gè)轉(zhuǎn)錄抑制因子LIP，它們均來源于同一個(gè)mRNA。在前脂肪細(xì)胞中，由于抗成脂基因的作用，成脂基因的活性處于抑制狀態(tài)。 晚期氧化蛋白產(chǎn)物（AOPP）作為近年來引起重視的一類與炎癥、氧化應(yīng)激密切相關(guān)的蛋白質(zhì)氧化交聯(lián)產(chǎn)物，是1

4、996年Witko-Sarsat等首先在尿毒癥血液透析患者循環(huán)中發(fā)現(xiàn)報(bào)道的一種尿毒癥毒素，主要存在于白蛋白中，酸性條件下在340nm有特異吸收峰。它是氧化應(yīng)激過程中由激活的中性粒細(xì)胞髓過氧化物酶產(chǎn)生的次氯酸（HClO）作用于蛋白質(zhì)而形成的，在體外用次氯酸（HOCl）作用于正常人血漿或純化的人血清白蛋白（HAS）亦可得到與尿毒癥病人血漿中相似的AOPP。已證實(shí)，慢性腎功能不全患者在早期血循環(huán)中AOPP即已升高，且隨著腎功能的惡化而進(jìn)行性增

5、高。AOPP被認(rèn)為是慢性腎衰竭患者更為敏感的氧化應(yīng)激的標(biāo)志物。體外研究表明，AOPP可引起中性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞呼吸爆發(fā)；刺激中性粒細(xì)胞合成白介素-8；刺激單核細(xì)胞合成炎癥細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子-α。血管內(nèi)皮細(xì)胞在AOPP的刺激下可產(chǎn)生活性氧。這些資料提示AOPP不僅是氧化應(yīng)激的產(chǎn)物，其本身也可能誘導(dǎo)或加重氧化應(yīng)激和炎癥。因此，脂肪組織中氧化修飾的蛋白也可能影響脂肪細(xì)胞功能。 AOPP作為氧化應(yīng)激的產(chǎn)物，其對(duì)前脂肪細(xì)胞的的分化成熟

6、是否有所影響未見報(bào)道，目前有越來越多的報(bào)道顯示前脂肪細(xì)胞能獲得吞噬特性及表達(dá)一些巨噬細(xì)胞的特異抗原如F4/80。本研究探討晚期氧化蛋白產(chǎn)物（AOPP）對(duì)前脂肪細(xì)胞的分化成熟的影響及機(jī)制，并觀察其是否可獲得炎性細(xì)胞的特性。本研究以體外培養(yǎng)的3T3-L1小鼠前脂肪細(xì)胞系作為脂肪細(xì)胞分化模型，發(fā)現(xiàn)AOPP可明顯抑制前脂肪細(xì)胞脂滴形成、成熟脂肪細(xì)胞標(biāo)記蛋白表達(dá)，并刺激前脂肪細(xì)胞大量表達(dá)多種炎癥細(xì)胞因子和巨噬細(xì)胞的特異抗原F4/80。本研究結(jié)果可

7、能對(duì)理解衰老脂肪組織萎縮和炎癥反應(yīng)有重要意義。 研究方法: 一、無內(nèi)毒素AOPP的制備與鑒定。 將純化無內(nèi)毒素20mg/mlMSA與40mmol/1次氯酸等體積混合，室溫放置30分鐘，制備出MSA與次氯酸摩爾比1：140的AOPP。制備的AOPP在無內(nèi)毒素PBS中透析24小時(shí)，以除去游離次氯酸（每4-6小時(shí)換液一次）。用0.22μm的微孔濾膜過濾除菌后4℃保存。20mg/mlMSA與PBS等體積混合，作為對(duì)照。A

8、OPP含量通過測(cè)定酸性條件下340nm的吸光度值，以氯胺T為標(biāo)準(zhǔn)取得。通過鱟試驗(yàn)法檢測(cè)，該方法制備的AOPP無內(nèi)毒素。 二、3T3-L1小鼠前脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化。 3T3-L1小鼠前脂肪細(xì)胞購自美國ATCC細(xì)胞庫。細(xì)胞復(fù)蘇后用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至完全融合2d后開始誘導(dǎo)分化（誘導(dǎo)分化第0天），即加含0.5mmol/L 3-異丁基1-甲基黃嘌呤（3-isob

9、utyl-1-methylxanthine，IBMX）、0.25μmol/L地塞米松（DEX）和10μg/ml胰島素（Insulin）的10%小牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)48 h，換含有10 μ/ml胰島素的培養(yǎng)液再培養(yǎng)48 h，隨后以10%小牛血清高糖DMEM的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每2d換培養(yǎng)液1次，直至第8天95%以上的細(xì)胞已經(jīng)分化為成熟的脂肪細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)組在常規(guī)誘導(dǎo)分化的同時(shí)，分別加入不同濃度AOPP （50μg/ml、100μg/m

10、l、200μg/ml）及200μg/ml未經(jīng)修飾MSA的培養(yǎng)液全程干預(yù)細(xì)胞分化過程，對(duì)照組加常規(guī)誘導(dǎo)劑。 三、3T3-L1脂肪細(xì)胞的鑒定。 應(yīng)用油紅O染色鑒定分化成熟的3T3-L1脂肪細(xì)胞。先用1×PBS洗3次，3.7%多聚甲醛固定細(xì)胞15-20 min，PBS洗凈后盡量吸干液體，加入0.5%油紅O染液（0.5g油紅粉末溶于60%的異丙醇100ml，過濾使用）于細(xì)胞表面，室溫作用1小時(shí)，后用水洗細(xì)胞以去除多余的染料。倒置

11、顯微鏡下觀察結(jié)果，拍攝照片，鑒定脂肪細(xì)胞分化成熟。實(shí)驗(yàn)各組脂肪細(xì)胞經(jīng)油紅O染色后，加2ml異丙醇溶解油紅O，用分光光度計(jì)測(cè)定各孔在490nm的OD值，以此反映胞內(nèi)甘油三酯含量的高低。 四、AP2、C/EBP-α、PPAR-γ、IL-6、TNF-α及MCP-1 mRNA水平表達(dá)的檢測(cè)。 將復(fù)蘇傳代后的3T3-L1前脂肪細(xì)胞接種于培養(yǎng)板，培養(yǎng)方法如上所述，與0、50、100、200μg/ml AOPP或200μg/ml未經(jīng)修

12、飾的MSA共同孵育，每次換液時(shí)都加入AOPP或MSA，干預(yù)整個(gè)分化過程，直至第8天加入Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA。按試劑盒說明進(jìn)行操作，RT-PCR測(cè)定：脂肪酸結(jié)合蛋白AP2、CCTTA增強(qiáng)子結(jié)合蛋白-alpha（C/EBP-α）、過氧化物酶體增殖物激活受體-gamma（PPAR-γ）、白介素-6 （IL-6）、 腫瘤壞死因-alpha （TNF-α）、及單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）的mRNA表達(dá)的濃度效應(yīng)。另外：①細(xì)胞

13、培養(yǎng)方法同前，分別在分化的第1天，2天，4天，6天，8天與200μg/mlAOPP共孵育，即AOPP對(duì)細(xì)胞的作用時(shí)間為8天、7天、6天、4天、2天。第8天提取細(xì)胞總RNA，RT-PCR測(cè)定AP2表達(dá)的時(shí)間效應(yīng)。②在檢測(cè)IL-6、TNF-α、MCP-1的mRNA水平時(shí)，未處理前脂肪細(xì)胞為對(duì)照，全培培養(yǎng)至細(xì)胞生長(zhǎng)融合即提取細(xì)胞總RNA。 五、IL-6、TNF-α及MCP-1蛋白水平表達(dá)的檢測(cè)。 細(xì)胞培養(yǎng)如前所述，對(duì)照組的前脂

14、肪細(xì)胞生長(zhǎng)至融合時(shí)即收集其細(xì)胞上清，其余組細(xì)胞與50、100、200μg/ml AOPP或200μg/ml未經(jīng)修飾的MSA共同孵育。第8天收集細(xì)胞上清，測(cè)細(xì)胞總蛋白的濃度。ELISA試劑盒檢測(cè)，細(xì)胞總蛋白矯正。 六、AP2、C/EBP-α、PPAR-γ、C/EBP-β、C/EBP-δ、CHOP、CUGBP及F4/80蛋白水平表達(dá)的檢測(cè)。 細(xì)胞培養(yǎng)如前所述，同時(shí)與50、100、200μg/ml AOPP或200μg/ml未

15、經(jīng)修飾的MSA共同孵育。收集第3天的細(xì)胞總蛋白，Western Blotting檢測(cè)：CCTTA增強(qiáng)子結(jié)合蛋白-β（C/EBP-β）、CCTTA增強(qiáng)子結(jié)合蛋白-δ（C/EBP-δ）、C/EBP同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP）、 （CUG）n triplet repeat RNA-binding protein （CUGBP）；收集第8天的細(xì)胞總蛋白，Western Blotting檢測(cè)表達(dá)于成熟

16、脂肪細(xì)胞的脂肪酸結(jié)合蛋白2（AP2）、巨噬細(xì)胞特異抗原F4/80、CCTTA增強(qiáng)子結(jié)合蛋白-alpha（C/EBP-α）、過氧化物酶體增殖物激活受體-gamma（PPAR-γ）。另外：①細(xì)胞培養(yǎng)方法同前，分別在分化的第0天，1天，2天，4天，6天，8天與200μg/mlAOPP共孵育，即AOPP對(duì)細(xì)胞的作用時(shí)間為8天、7天、6天、4天、2天、0天。第8天收集細(xì)胞總蛋白，Western Blotting測(cè)定AP2表達(dá)的時(shí)間效應(yīng)。②細(xì)胞與2

17、00μg/ml AOPP共同孵育，分別收集12h、24h、48h、72h、96h的細(xì)胞總蛋白，Western Blotting檢測(cè)C/EBP-β、C/EBP-δ、CHOP及CUGBP的表達(dá)（CIEBP-β的表達(dá)的高低以LAP與LIP的相對(duì)比值來表示）。 七、統(tǒng)計(jì)方法。 所有數(shù)據(jù)均代表3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。所有統(tǒng)計(jì)由統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 13.0完成。多個(gè)樣本均數(shù)的比較采用One-Way ANOVA，兩兩比較

18、采用LSD，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；兩樣本均數(shù)的比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論： 本研究發(fā)現(xiàn)AOPP可抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞的分化成熟，并刺激前脂肪細(xì)胞表達(dá)多種炎癥細(xì)胞因子；該效應(yīng)可能與抑制前脂肪細(xì)胞成脂基因（C/EBP-α、PPAR-γ）的表達(dá)和上調(diào)抗成脂轉(zhuǎn)錄因子（C/EBP β-LIP、CUGBP、CHOP）的表達(dá)有關(guān)。AOPP可能參與抑制前脂肪細(xì)胞分化并促進(jìn)其向炎癥樣細(xì)胞表型