PEDF通過阻斷MAPK-ERK途徑抑制3T3-L1前脂肪細胞向成熟脂肪細胞分化.pdf

1、研究背景：
　　 肥胖是以過多的脂肪組織堆積為特點的，是心血管疾病、糖尿病、高血壓病及癌癥等多種疾病的高危因素。而目前認為脂肪組織不僅是甘油三酯最大的儲存庫，而且是人體的很重要的內(nèi)分泌器官之一。據(jù)估計，脂肪組織內(nèi)20％-30％的基因可以表達可分泌的蛋白，它們包括：前炎性細胞因子，如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)、脂聯(lián)素、纖溶蛋白及其他類激素類蛋白如瘦素和抵抗素等，并把這些有生物活性的分子，統(tǒng)稱為脂肪因

2、子。色素上皮衍生因子(PEDF)是最近認定的脂肪因子之一。這些脂肪因子通過自分泌、旁分泌、內(nèi)分泌的形式發(fā)揮生物學作用。脂肪組織通過這些脂肪因子在炎癥、能量代謝、胰島素敏感性等方面發(fā)揮很重要的作用。
　　 PEDF是一個分子量為50千道爾頓的單體糖蛋白，是絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族中的一員，含418個氨基酸，位于染色體17p13，但因缺少絲氨酸反應環(huán)而缺乏抑制蛋白水解酶的活性作用，最近被確定為是脂肪細胞分泌的脂肪因子之一。PEDF最

3、早由Tombran-Tink等從人胎兒視網(wǎng)膜色素上皮細胞培養(yǎng)調(diào)理液中純化分離出來，能誘導培養(yǎng)Y79視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞的神經(jīng)元分化，具有神經(jīng)營養(yǎng)作用。PEDF由視網(wǎng)膜色素上皮細胞(RPE)旁分泌至視網(wǎng)膜感光細胞問基質(zhì)，對視網(wǎng)膜的分化起重要作用。繼而，PEDF被發(fā)現(xiàn)在血管生成、神經(jīng)元分化、炎癥及氧化應激中均起著很重要的作用。例如，在內(nèi)皮細胞，PEDF抑制細胞的增殖、遷移、管型形成、誘導內(nèi)皮細胞的凋亡；在腎小球系膜細胞，PEDF不影響細胞生長

4、，但抑制系膜細胞的擴張和纖維化因子的表達；在巨噬細胞，PEDF抑制細胞的凋亡和阻礙巨噬細胞的活化。另外，PEDF促進脊髓運動神經(jīng)元的生長和分化。
　　 最近有報道在2型糖尿病病人的血漿PEDF水平明顯增加，這一趨勢與體重指數(shù)呈正相關；在代謝綜合征的病人、1型糖尿病的病人或者健康對照者中血漿或血清水平的PEDF與體型肥胖是明顯相關的。但是，PEDF的改變在這些肥胖相關的疾病中的作用還不清楚。因此，研究PEDF在脂肪生成和脂肪細胞生

5、理中的作用，對于闡明PEDF和肥胖之間的潛在聯(lián)系和機理，指導肥胖的治療，控制心腦血管病的危險因素等有重要意義。
　　 研究目的：
　　 本研究以小鼠的3T3-L1細胞為脂肪細胞模型，探討PEDF在3T3-L1前脂肪細胞向成熟脂肪細胞分化過程中的作用及其機制。
　　 方法：
　　 1、3T3-L1前脂肪細胞的培養(yǎng)及誘導分化：3T3-L1細胞株購自ATCC，復蘇后在含10％的小牛血清的改良Eagle培養(yǎng)基(D

6、MEM)液中培養(yǎng)至95％-100％，接觸抑制兩天后用經(jīng)典的激素雞尾酒方案誘導細胞分化成成熟的脂肪細胞，直至細胞內(nèi)出現(xiàn)帶有花環(huán)型的成熟的脂滴環(huán)形排列，且分化成熟的細胞占總細胞數(shù)的95％以上。成熟的脂肪細胞中的脂滴可以用油紅染色來鑒定。
　　 2、免疫印跡法(Western-Blot)檢測目標蛋白的表達：提取細胞總蛋白，通過Western-Blot分析檢測脂肪細胞型脂肪酸結(jié)合蛋白(aP2)、脂肪甘油三酯脂酶(ATGL)、激素敏感性脂

7、肪酶(HSL)、CCAAT-增強子結(jié)合蛋白α(CEBP/-α)、CCAAT-增強子結(jié)合蛋白β(CEBP/-β)、前脂肪細胞因子-1(Pref-1)、過氧化物酶體增生物激活受體γ(PPAR-γ)、在蘇氨酸202和酪氨酸204位點上磷酸化的絲裂原激活蛋白激酶(phospho-p42/44 MAPK at Thr202/Tyr204)、總的胞外信號調(diào)節(jié)激酶(total ERK)、蘇氨酸180和酪氨酸182位點上磷酸化的p38(phospho-

8、p38 at Thr180/Tyr182)、總p38(total p38)、在蘇氨酸188位點上磷酸化的CCAAT-增強子結(jié)合蛋白β(phospho-C/EBP-β at Thr188)的蛋白表達水平。
　　 3、實時熒光定量PCR：收集脂肪細胞提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過Real-timePCR檢測前脂肪細胞因子-1(Pref-1)和PEDF的基因表達水平。
　　 4、酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測前脂肪細胞和脂

9、肪細胞中分泌的PEDF：分別收集前脂肪細胞和脂肪細胞的培養(yǎng)液，通過ELISA方法檢測培養(yǎng)液中的PEDF水平。
　　 5、細胞增殖計算：測量細胞DNA增殖的含量來分析細胞的增殖情況，熒光強度在熒光顯微鏡的激發(fā)波長為485nm，發(fā)射波長為530nm在熒光微板上讀出。
　　 6、統(tǒng)計學分析：所有的實驗至少重復三次。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示。兩組間比較采用t檢驗，三組或以上之間的比較采用ANOVA中的Bonferroni's po

10、st hoc檢驗。當P值小于0.05時有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)果：
　　 1、在前脂肪細胞開始分化的早期，加入生理濃度范圍內(nèi)的人PEDF能抑制脂肪細胞內(nèi)脂滴形成，下調(diào)脂肪細胞標志蛋白脂肪細胞型脂肪酸結(jié)合蛋白(aP2)、脂肪甘油三酯脂酶(ATGL)和激素敏感性脂肪酶(HSL)。
　　 2、采用表達PEDF基因的腺病毒感染3T3-L1細胞方法，發(fā)現(xiàn)PEDF過表達同樣能抑制脂肪細胞內(nèi)脂滴形成及下調(diào)脂肪細胞內(nèi)標志性蛋白的

11、表達。但在前脂肪細胞開始分化的中期加入PEDF并沒有抑制前脂肪細胞分化的作用。
　　 3、在前脂肪細胞分化的早期，加入生理濃度范圍內(nèi)的PEDF能抑制主要的促進脂肪細胞生成的轉(zhuǎn)錄因子如CCAAT-增強子結(jié)合蛋白α(C/FBP-α)和過氧化物酶體增生物激活受體γ(PPAR-γ)的蛋白表達，但是在前脂肪細胞分化的中期加入PEDF對C/EBP-α和PPAR-γ的蛋白表達無作用。
　　 4、PEDF或者絲裂原激活蛋白激酶/胞外信號

12、調(diào)節(jié)激酶(MAPK/ERK)特異性的抑制物U0126能順序性的抑制早期ERK的活化及誘導液誘導的細胞克隆性增生。而且，PEDF能在蘇氨酸188位點上抑制CCAAT-增強子結(jié)合蛋白β(C/EBP-β)的磷酸化。
　　 5、PEDF的mRNA水平在細胞開始分化的第一個24小時內(nèi)明顯減少，并且脂肪細胞分泌的PEDF較前脂肪細胞分泌的PEDF明顯減少。
　　 結(jié)論：
　　 1、PEDF可能通過抑制前脂肪細胞的克隆性增生來