Brd2在3T3-L1前脂肪細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化過程中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、脂肪組織主要由脂肪細(xì)胞所組成，過多的熱量攝入并以甘油三酯的形式儲(chǔ)存在白色脂肪細(xì)胞內(nèi)是肥胖發(fā)生的關(guān)鍵。前脂肪細(xì)胞的增殖分化是成熟脂肪細(xì)胞形成的核心，從前脂肪細(xì)胞分化成成熟的脂肪細(xì)胞的過程十分復(fù)雜，特別是機(jī)體內(nèi)多種細(xì)胞因子和激素在脂肪細(xì)胞發(fā)生過程中可能都有調(diào)節(jié)作用。
　　BRD2屬于BET蛋白家族，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中廣泛表達(dá)，具有多種生物學(xué)功能，最新的研究表明Brd2基因突變能導(dǎo)致小鼠過度肥胖而不引起糖尿病，但是其作用的分子機(jī)制并不明確

2、。在本課題中，我們觀察了Brd2表達(dá)變化對(duì)前脂肪細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化過程的影響，并且重點(diǎn)研究了Brd2參與的信號(hào)通路在影響前脂肪細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化作用的分子機(jī)制，彌補(bǔ)了這一部分研究的空白。
　　在研究中，我們發(fā)現(xiàn)Brd2表達(dá)的下調(diào)，能促使3T3-L1前脂肪細(xì)胞向脂肪細(xì)胞的分化，甚至在無任何誘導(dǎo)分化劑的情況下，部分細(xì)胞也能分化成脂肪細(xì)胞;相反的，當(dāng)Brd2過表達(dá)時(shí)，即使誘導(dǎo)分化至第8天，細(xì)胞分化也幾乎完全被抑制。這就更加表明Brd2在

3、前脂肪細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化過程中有重要的作用，同時(shí)我們認(rèn)為，上述現(xiàn)象的產(chǎn)生可能是由于Brd2表達(dá)的變化影響了一些分化相關(guān)基因甚至是關(guān)鍵基因的表達(dá)。
　　為了研究Brd2表達(dá)的變化對(duì)脂肪細(xì)胞分化相關(guān)基因表達(dá)的影響，一方面我們利用RNA干擾技術(shù)，下調(diào)3T3-L1前脂肪細(xì)胞內(nèi)Brd2的表達(dá)水平;另一方面運(yùn)用將pmBrd2載體將Brd2基因?qū)?T3-L1前脂肪細(xì)胞，使細(xì)胞內(nèi)的Brd2過表達(dá)，然后先通過RT-PCR技術(shù)檢測(cè)了PPARγ和C/

4、EBPα的時(shí)序性表達(dá)，結(jié)果表明Brd2對(duì)脂肪細(xì)胞分化的兩個(gè)關(guān)鍵基因PPARγ和C/EBPα都有顯著的負(fù)調(diào)節(jié)作用;繼而運(yùn)用Q-PCR技術(shù)，我們又檢測(cè)了其它相關(guān)基因的表達(dá)，結(jié)果顯示，422/aP2、Glut4、Leptin和Irs-1的表達(dá)都有顯著的改變，而Pfkfb1的表達(dá)則沒有受到明顯的影響。已有研究證明PPARγ是ERK的下游分子，當(dāng)ERK通路激活后，PPARγ發(fā)生磷酸化，轉(zhuǎn)錄活性降低從而抑制了分化，而Wang等的研究又證明了Brd2

5、可抑制PPARγ的轉(zhuǎn)錄活性，由此我們首先推斷Brd2可能通過ERK信號(hào)通路影響脂肪細(xì)胞的分化;其次，Glut4表達(dá)的變化直接關(guān)系到細(xì)胞的糖攝取量，而在脂肪細(xì)胞中，與糖代謝密切相關(guān)的Insulin信號(hào)通路和AMPK信號(hào)通路都可刺激GLUT4的轉(zhuǎn)位，促進(jìn)細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取，其中Insulin信號(hào)是通過IGF-1R激活了IRS-1和IRS-2再進(jìn)一步激活PI3K/Akt信號(hào)通路，最后作用于GLUT4;而在AMPK信號(hào)通路中，AICAR則可不依

6、賴于Insulin作用而直接激活A(yù)MPK，進(jìn)而刺激GLUT4的轉(zhuǎn)位。在Wang等的研究中，Brd2缺失的小鼠進(jìn)食量劇增，但其血糖水平并未隨攝糖量的急劇增加而升高，反而與野生型小鼠相比有所下降，因此，我們認(rèn)為Brd2可能通過Insulin和AMPK信號(hào)通路來共同調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞的糖代謝。
　　為了證實(shí)Brd2是否通過ERK信號(hào)通路影響脂肪細(xì)胞的分化，我們先利用RNA干擾技術(shù)使3T3-L1細(xì)胞內(nèi)的Brd2基因沉默，然后再通過轉(zhuǎn)染pmBrd

7、2使細(xì)胞內(nèi)的Brd2過表達(dá)，隨后檢測(cè)Brd2表達(dá)的變化對(duì)ERK、Raf和JNK的磷酸化水平的影響，結(jié)果表明ERK的磷酸化水平有明顯的變化，但其上游的Raf則未受到明顯的影響，同時(shí)JNK信號(hào)通路也與此過程無關(guān);然后為了進(jìn)一步確定ERK信號(hào)通路在該過程中的作用，我們觀察了ERK激酶MEK1的特異性化學(xué)抑制劑U0126對(duì)此過程的影響，結(jié)果表明U0126可使Brd2過表達(dá)的細(xì)胞部分恢復(fù)分化，同時(shí)aP2的表達(dá)也得以回調(diào)。綜合以上結(jié)果可證實(shí):ERK

8、信號(hào)通路參與了Brd2調(diào)節(jié)3T3-L1前脂肪細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化的過程，而JNK信號(hào)通路則與之無關(guān)。
　　同樣，為了證實(shí)Brd2可能通過Insulin和AMPK信號(hào)通路來共同調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞糖代謝，我們利用RNA干擾手段下調(diào)Brd2的表達(dá)后發(fā)現(xiàn)Akt的磷酸化水平明顯升高，而通過PI3K的特異性化學(xué)抑制劑LY294002可使Akt升高的活性降低，相反的，當(dāng)Brd2過表達(dá)時(shí)，Akt的活性則受到了抑制;同時(shí)，在研究AMPK信號(hào)通路中，我們發(fā)現(xiàn)

9、Brd2具有負(fù)調(diào)節(jié)AMPK活性的作用:當(dāng)Brd2表達(dá)下調(diào)時(shí)，AMPK的磷酸化水平明顯升高，而通過AMPK的特異性化學(xué)抑制劑Compound C和Insulin都可降低AMPK的升高的活性，反之，當(dāng)Brd2過表達(dá)時(shí)，AMPK的活性則受到了抑制;并且當(dāng)Brd2基因沉默時(shí)，PI3K的特異性化學(xué)抑制劑LY294002和AMPK的特異性化學(xué)抑制Compound C都能使GLUT4蛋白表達(dá)水平顯著下降。但是Brd2表達(dá)的變化對(duì)于GSK-3的活性卻并

10、不產(chǎn)生影響。由此，上述結(jié)果證實(shí)了我們的猜想:Brd2通過Insulin信號(hào)通路和AMPK信號(hào)通路調(diào)節(jié)3T3-L1前脂肪細(xì)胞GLUT4的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取，但并不影響細(xì)胞的糖原合成。
　　綜上所述，在本研究中，我們證實(shí)了Brd2在3T3-L1前脂肪細(xì)胞中參與了ERK、Akt和AMPK信號(hào)通路，調(diào)控了某些相關(guān)基因的表達(dá)，影響了前脂肪細(xì)胞向脂肪細(xì)胞的分化和糖代謝，但對(duì)ERK、Akt和AMPK信號(hào)通路中涉及的有關(guān)轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)