長鏈非編碼RNA U90926在3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化中的作用及其機制研究.pdf

1、肥胖癥是體內(nèi)的脂肪組織過度蓄積所導(dǎo)致的一種疾病。研究證實，肥胖癥是許多慢性疾病的主要危險因素，可以增加糖尿病、心血管疾病和癌癥的發(fā)病率。近幾年內(nèi)肥胖癥有急劇增長的趨勢，尤其在發(fā)達國家，也包括經(jīng)濟迅速增長的發(fā)展中國家。研究肥胖發(fā)生、發(fā)展的機制可為人類防治肥胖、提高生活質(zhì)量提供有價值的理論依據(jù)。
　　肥胖癥通常可表現(xiàn)為脂肪細(xì)胞數(shù)量增多和/或體積增大。因此，脂肪細(xì)胞和肥胖癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。從前脂肪細(xì)胞到成熟脂肪細(xì)胞生成的過程稱為成脂

2、分化，而此過程對脂肪組織蓄積和肥胖的形成至關(guān)重要。因而，脂肪細(xì)胞的分化過程及相關(guān)的調(diào)控機制已經(jīng)成為研究肥胖及相關(guān)疾病的核心。
　　長鏈非編碼RNA(longnoncodingRNA，lncRNA)是一類長度大于200個核苷酸(nucleotide，nt)的RNA分子，通常具有polyA尾巴，并且具有以下幾個特點:1）表達豐度低于蛋白質(zhì)編碼基因;2）物種間保守性差;3）缺乏開放閱讀框（openreadingframes，ORFs）從

3、而無編碼蛋白質(zhì)的能力;4）組織特異性表達。
　　由于對其功能認(rèn)識的不充分，在20世紀(jì)90年代，lncRNA一度被認(rèn)為是轉(zhuǎn)錄過程中的“噪音”，是RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物。隨著分子生物學(xué)實驗技術(shù)的發(fā)展，近年來，lncRNA與多種復(fù)雜疾病發(fā)生之間的關(guān)系逐漸受到關(guān)注。研究顯示，lncRNA可以在多種生物學(xué)過程中發(fā)揮豐富多樣的調(diào)控作用，比如可以調(diào)控mRNA的降解、X染色體失活、剪接調(diào)控、轉(zhuǎn)錄激活、染色質(zhì)重塑等，通過以上作用方式最終參與到細(xì)

4、胞增殖、分化、凋亡，物質(zhì)代謝，腫瘤發(fā)生等過程中。也有文獻報道，lncRNA可以調(diào)控前脂肪細(xì)胞的分化，這為人們研究肥胖的發(fā)病機制乃至預(yù)防和治療肥胖癥提供了新的思路。
　　本課題研究內(nèi)容分為以下兩個部分:
　　第一部分長鏈非編碼RNAU90926(lncRNAU90926)在3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化過程中的變化及其與肥胖癥的關(guān)聯(lián)
　　研究目的:探討lncRNAU90926在小鼠3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化為成熟脂肪細(xì)胞過程

5、中的表達變化及其與肥胖癥的關(guān)聯(lián)
　　研究內(nèi)容:
　　1.以3T3-L1前脂肪細(xì)胞為模型，用脂肪細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)其分化。用油紅0鑒定脂滴形成，并在分化的第0、2、4、13天收集細(xì)胞做包含編碼基因和非編碼基因的全轉(zhuǎn)錄組圖譜分析，即microarray分析，尋找差異表達基因。收集誘導(dǎo)分化不同時間（第0、4、8、12天）的脂肪細(xì)胞并提取RNA，用qPCR技術(shù)驗證microarray分析所得結(jié)果。
　　2.采用熒光原位雜交(f

6、luorescentinsituhybridization，F(xiàn)ISH)實驗檢測長鏈非編碼RNAU90926(lncRNAU90926)在3T3-L1前脂肪細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位。
　　3.肥胖動物模型的建立:選用6周齡雄性C57BL/6J小鼠、ob/ob小鼠和db/db小鼠為實驗材料。適應(yīng)性喂養(yǎng)一周之后，C57BL/6J小鼠隨機分為3組，一組給予基礎(chǔ)飼料（脂肪含量5％）喂養(yǎng)，另兩組給予高脂飼料（脂肪含量20％）喂養(yǎng)，其中一組高脂飲食的

7、小鼠用來做為ob/ob小鼠和db/db小鼠的對照。ob/ob小鼠和db/db小鼠喂養(yǎng)高脂飼料以期快速達到肥胖狀態(tài)，每周稱動物體重一次，4周之后，ob/ob小鼠和db/db小鼠體重增長超過對照組小鼠體重的30％，造模成功;另一組高脂飲食的C57BL/6J小鼠亦每周稱重一次，直至體重超過基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)的C57BL/6J小鼠體重的30％，此時即造模成功。
　　造模成功之后，深度麻醉處死小鼠，提取其皮下脂肪組織和內(nèi)臟脂肪組織（腎周脂肪和附睪

8、脂肪），同時提取心臟、肝臟、脾臟、腎臟、肺臟、睪丸、棕色脂肪組織進行下述相關(guān)檢測:
　　1)取小鼠心臟、肝臟、脾臟、腎臟、肺臟、睪丸、棕色脂肪組織和附睪脂肪組織提取RNA進行實時熒光定量核酸擴增實驗，分析lncRNAU90926在不同組織間的表達差異。
　　2)取肥胖小鼠和各自對照小鼠皮下脂肪和內(nèi)臟脂肪組織，提取RNA，檢測lncRNAU90926、PPARγ2(peroxisomeproliferator-activate

9、dreceptorgamma2,過氧化物酶體增殖物激活受體γ2)、FABP4（fattyacidbindingprotein4，月旨肪酸結(jié)合蛋白4）和AdipoQ（adiponectin，脂聯(lián)素）在不同肥胖動物中的mRNA表達變化。
　　研究結(jié)果:
　　1.3T3-L1前脂肪細(xì)胞經(jīng)過誘導(dǎo)能分化成為成熟脂肪細(xì)胞，油紅O染色可以看到大量的脂滴聚積。分化不同天數(shù)細(xì)胞的microarray結(jié)果顯示，隨著3T3-L1前脂肪細(xì)胞的分化，

10、lncRNAU90926的表達呈逐漸下降趨勢。收集分化過程中的細(xì)胞提取RNA進行qPCR驗證，其結(jié)果與microarray實驗相一致。
　　2.FISH實驗表明，lncRNAU90926主要分布于3T3-L1前脂肪細(xì)胞胞質(zhì)中，同時細(xì)胞核中也有少量lncRNAU90926存在。
　　3.經(jīng)過4周喂養(yǎng)，ob/ob小鼠和db/db小鼠體重增長超過對照組小鼠30％，造模成功;經(jīng)過12周喂養(yǎng)，高脂飲食的C57BL/6J小鼠體重超過基礎(chǔ)

11、飼料喂養(yǎng)的C57BL/6J小鼠體重的30％，亦造模成功。
　　4.對小鼠包括附睪脂肪在內(nèi)的8個臟器組織提取RNA，qPCR擴增lncRNAU90926，結(jié)果顯示lncRNAU90926主要存在但不局限于白色脂肪組織中，在其他組織也有表達，但其表達豐度較低。
　　5.分別提取各組小鼠皮下、腎周和附睪脂肪組織，分離獲得成熟脂肪細(xì)胞，檢測lncRNAU90926表達，結(jié)果表明無論是高脂喂養(yǎng)肥胖小鼠還是ob/ob和db/db肥胖小鼠

12、，其脂肪組織中l(wèi)ncRNAU90926含量均顯著低于各自對照組小鼠。而各肥胖組小鼠脂肪組織中PPARγ2、FABP4和AdipoQ的表達量均明顯高于對照組小鼠。
　　研究結(jié)論:
　　1.3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化過程中l(wèi)ncRNAU90926的表達量逐漸降低。
　　2.lncRNAU90926主要分布于小鼠白色脂肪組織中，且在脂肪細(xì)胞中絕大部分定位于細(xì)胞質(zhì)。
　　3.lncRNAU90926在肥胖小鼠中表達低于對

13、照小鼠，即lncRNAU90926與肥胖負(fù)相關(guān)。
　　第二部分長鏈非編碼RNAU90926(lncRNAU90926)對3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化的影響及其相關(guān)機制研究
　　研究目的:研究lncRNAU90926對3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化過程的影響及其相關(guān)機制
　　研究內(nèi)容:
　　1.用過表達lncRNAU90926的慢病毒和對照病毒分別感染3T3-L1前脂肪細(xì)胞，經(jīng)嘌呤霉素篩選建立穩(wěn)定過表達lncRNAU90

14、926的3T3-L1細(xì)胞克隆和對照細(xì)胞，誘導(dǎo)分化，以油紅O鑒定脂滴聚積，收集分化第0、6天的細(xì)胞提取RNA，鑒定PPARγ2、FABP4和AdipoQ的表達。收集分化第0、2、4、6、8、10、12天的細(xì)胞進行WesternBlotting實驗，檢測PPARγ2和FABP4的蛋白表達變化。
　　2.設(shè)計靶向抑制小鼠lncRNAU90926基因的shRNA序列，構(gòu)建重組慢病毒載體GV118-U90926-shRNA（以GV118-C

15、ON為對照）并包裝慢病毒。用適宜滴度的慢病毒感染小鼠3T3-L1前脂肪細(xì)胞，鑒定并誘導(dǎo)其分化，用油紅O染色鑒定脂肪細(xì)胞分化程度，并收集分化第0、12天的細(xì)胞提取RNA，檢測PPARγ2、FABP4、C/EBPα(CCAAT/enhancerbindingproteinα，CCAAT/增強子結(jié)合蛋白α)和AdipoQ的表達。收集分化過程中第0、2、4、6天的絀胞進行WesternBlotting實驗，檢測PPAR和FABP4的蛋白水平變化

16、。
　　3.用雙熒光素酶實驗檢測lncRNAU90926對轉(zhuǎn)錄因子C/EBPα，C/EBPβ和PPARγ2轉(zhuǎn)錄活性的影響。檢索NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation)和Ensemble數(shù)據(jù)庫，查找小鼠incRNAU90926基因序列以及C/EBPα，C/EBPβ和PPARγ2基因的啟動子序列，用基因體外重組的方法構(gòu)建過表達lncRNAU90926的載體以及C/EBPα，C/EB

17、P/和PPARγ2包含全長及部分截短片段啟動子的報告基因，共轉(zhuǎn)染Hela絀胞之后，檢測熒光素酶活性以判斷l(xiāng)ncRNAU90926對C/EBPα，C/EBPβ和PPARγ2轉(zhuǎn)錄活性的作用。
　　研究結(jié)果:
　　1.分別用過表達lncRNAU90926的慢病毒和對照病毒感染3T3-L1前脂肪細(xì)胞，經(jīng)過嘌呤霉素篩選，擴增，得到穩(wěn)定過表達lncRNAU90926的細(xì)胞株，經(jīng)過qPCR檢測發(fā)現(xiàn)過表達細(xì)胞株(OV)lncRNAU9092

18、6比對照細(xì)胞株(NC)顯著升高，選出3對克隆進行后續(xù)實驗。分別對兩組細(xì)胞（OV及NC）進行誘導(dǎo)分化，于分化不同時期進行油紅O染色，染色結(jié)果顯示，過表達組細(xì)胞脂滴聚積能力明顯低于對照組。分別收取兩組細(xì)胞在分化的第0及12天的RNA并進行qPCR檢測，實驗結(jié)果表明，過表達組前脂肪細(xì)胞（即第0天的細(xì)胞）中PPARγ2和FABP4mRNA水平與對照組相比表達顯著降低，成熟脂肪細(xì)胞（即分化第12天的細(xì)胞）中PPARγ2、FABP4和AdipoQ的

19、表達亦明顯低于對照組細(xì)胞。對兩組細(xì)胞分化不同時期收取的蛋白進行WesternBlotting分析，發(fā)現(xiàn)兩組細(xì)胞中PPARγ和FABP4蛋白表達均隨分化逐漸升高，但過表達組中二者蛋白表達顯著低于對照組。
　　2.分別用3條靶向lncRNAU90926的shRNA序列的慢病毒及對照病毒感染3T3-L1前脂肪細(xì)胞，用感染后的細(xì)胞群體進行實驗觀察，選擇一條lncRNAU90926敲低效率最高的shRNA病毒用于建立穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，即敲低組細(xì)胞

20、(KD)，同時篩選用對照病毒感染所得到的對照組細(xì)胞(CON)。分別對敲低組(KD)和對照組(CON)細(xì)胞進行誘導(dǎo)分化，油紅O染色鑒定分化程度，結(jié)果顯示敲低組脂滴聚積明顯高于對照組。分別收取兩組細(xì)胞分化至第0、6天的RNA進行qPCR分析，實驗結(jié)果表明，未分化前（第0天），敲低組細(xì)胞中PPARγ2、FABP4和AdipoQmRNA水平比對照組高，分化6天時敲低組細(xì)胞中PPARγ2、FABP4、C/EBPα和AdipoQ的表達亦明顯高于對照

21、組細(xì)胞。分別收取兩組絀胞在誘導(dǎo)分化的第0、2、4、6天的樣品提取蛋白進行WesternBlotting分析，發(fā)現(xiàn)兩組細(xì)胞中PPARγ和FABP4蛋白表達均隨分化逐漸升高，但敲低組細(xì)胞中二者表達明顯高于對照組細(xì)胞。
　　3.熒光素酶實驗分析表明，在Hela細(xì)胞中過表達lncRNAU90926對C/EBPα和C/EBPβ的轉(zhuǎn)錄活性沒有影響，但可以降低PPARγ2全長啟動子轉(zhuǎn)錄活性的50％，進一步進行PPARγ2啟動子截短分析之后發(fā)現(xiàn)，

22、人為去除PPARγ2啟動子-2000bp到-1500bp的片段之后，過表達lncRNAU90926失去抑制PPARγ2全長啟動子轉(zhuǎn)錄活性的能力。
　　研究結(jié)論:
　　1.在小鼠3T3-L1前脂肪細(xì)胞中過表達lncRNAU90926可以抑制其分化。
　　2.敲低lncRNAU90926可以促進小鼠3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化。
　　3.lncRNAU90926可以抑制PPARγ2啟動子的轉(zhuǎn)錄活性，從而抑制3T3-L1