RNA干擾技術(shù)抑制3T3-L1脂肪細(xì)胞中脂聯(lián)素的表達(dá).pdf

1、目的：優(yōu)化3T3-L1前脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化方案；觀察細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中的生理學(xué)及形態(tài)學(xué)變化。 方法：常規(guī)培養(yǎng)前脂肪細(xì)胞，采用IBMX+地塞米松+胰島素+DMEM+10％FCS誘導(dǎo)方案分化細(xì)胞48h，再用含胰島素的DMEM+10％FCS培養(yǎng)48h，然后用DMEM+IO％FCS維持培養(yǎng)直至分化成熟；光鏡下及油紅0染色觀察第O天，第5天，以及第9天細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變。 結(jié)果：分化后的3T3-L1前脂肪細(xì)胞逐漸變圓，突觸收縮，體積

2、增大，光鏡下立體感增強(qiáng)，胞漿內(nèi)出現(xiàn)較多大而圓的脂滴，油紅O染色呈桔紅色。到第9天，大部分前體細(xì)胞分化為能分泌脂聯(lián)素的成熟脂肪細(xì)胞，可用于第二階段實(shí)驗(yàn)。 結(jié)論：采用該誘導(dǎo)分化及進(jìn)展維持方案，細(xì)胞分化成功率高，分化進(jìn)度均一，且盡可能的避免了分化刺激因子對(duì)脂聯(lián)素表達(dá)的抑制作用，為第二階段實(shí)驗(yàn)提供了良好的細(xì)胞模型。 目的：設(shè)計(jì)并構(gòu)建針對(duì)脂聯(lián)素基因的短發(fā)夾狀RNA(SmallhairpinRNAs，shRNA)重組質(zhì)粒，

3、觀察其抑制脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素表達(dá)的作用。 方法：設(shè)計(jì)、合成3對(duì)脂聯(lián)素編碼基因的反向重復(fù)序列，分別定向克隆至載體psilencerl．O的U6轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子下游，構(gòu)建psi-ACRP30．1，2，3重組質(zhì)粒，然后分別轉(zhuǎn)染分化成熟的脂肪細(xì)胞，并將上述處理后的細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組；轉(zhuǎn)染psi-GFP的細(xì)胞作為陰性對(duì)照組；成熟脂肪細(xì)胞作為正常對(duì)照組。用ELISA和免疫組織化學(xué)法觀測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)脂聯(lián)素在細(xì)胞培養(yǎng)上清液和細(xì)胞內(nèi)的含量變化，繪制脂聯(lián)素分泌曲線

4、。 結(jié)果：正常組和陰性對(duì)照組脂聯(lián)素分泌曲線維持在較高水平，無明顯波動(dòng)；與之相比，實(shí)驗(yàn)組脂聯(lián)素表達(dá)和分泌呈下降趨勢(shì)，轉(zhuǎn)染后48h降低最明顯，且轉(zhuǎn)染后72h脂聯(lián)素濃度仍未恢復(fù)到O點(diǎn)水平。轉(zhuǎn)染后48h實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)脂聯(lián)素表達(dá)較對(duì)照組明顯減少。 結(jié)論：構(gòu)建的psi-ACRP30重組質(zhì)粒能特異、有效地抑制脂聯(lián)素基因在脂肪細(xì)胞中的表達(dá)。這可能為研究脂聯(lián)素減少與胰島素抵抗發(fā)生的病理生理機(jī)制間的關(guān)系提供了一個(gè)經(jīng)濟(jì)有效的研究手段。