不同類型脂肪酸對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素表達(dá)的影響及其與PPARγ、Cdk5的關(guān)系.pdf

1、脂聯(lián)素是一種脂肪細(xì)胞因子，因其在防治心血管疾病、降低肥胖患者體重、降血糖等方面發(fā)揮的作用而備受關(guān)注。許多研究表明膳食因素可影響脂聯(lián)素的表達(dá)，以脂肪酸的影響最為顯著。而脂肪酸根據(jù)其碳鏈長(zhǎng)短及其飽和程度不同可分為飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸。許多研究表明，不同類型脂肪酸的作用存在差異。另有研究發(fā)現(xiàn)在脂聯(lián)素基因的啟動(dòng)子上存在過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator activated rece

2、ptorγ，PPARγ）的反應(yīng)元件，PPARγ激動(dòng)劑通過(guò)上調(diào)脂聯(lián)素的表達(dá)進(jìn)而使胰島素的敏感性增強(qiáng)。研究還發(fā)現(xiàn)，高脂飲食可激活細(xì)胞周期性蛋白激酶Cdk5(Cyclin-DependentKinase5)，導(dǎo)致PPARγ第273位的絲氨酸磷酸化，進(jìn)而降低PPARγ對(duì)脂聯(lián)素的特定靶基因的調(diào)控，使脂聯(lián)素表達(dá)降低。那么不同類型的脂肪酸對(duì)脂聯(lián)素表達(dá)的影響如何呢？作為PPARγ的天然配體的脂肪酸是否能通過(guò)PPARγ和（或者）Cdk5-PPARγ途徑來(lái)

3、調(diào)節(jié)脂聯(lián)素表達(dá)呢？
　　目的:
　　本研究擬以體外培養(yǎng)并誘導(dǎo)分化成熟的3T3-L1脂肪細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察不同濃度、不同類型的脂肪酸對(duì)3T3-L1成熟脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素分泌和表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)脂肪酸調(diào)節(jié)脂聯(lián)素表達(dá)和分泌的規(guī)律;觀察在不同脂肪酸及同一脂肪酸不同濃度作用下脂聯(lián)素與PPARγ、Cdk5的關(guān)系，為進(jìn)一步探討脂肪酸調(diào)節(jié)脂聯(lián)素表達(dá)的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。其研究結(jié)果將為肥胖及肥胖相關(guān)疾病的防治提供新的思路和科學(xué)依據(jù)。
　　方法

4、:
　　1.選用不同濃度(25、50、100、200、400μmol/L)的n-3系多不飽和脂肪酸:二十碳五稀酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)、α-亞麻酸(α-ALA)，n-6系多不飽和脂肪酸:花生四烯酸(AA)、亞油酸(LA)，單不飽和脂肪酸:油酸(OA)及飽和脂肪酸:棕櫚酸(PA)分別處理體外培養(yǎng)并誘導(dǎo)分化成熟的3T3-L1脂肪細(xì)胞24h，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照、陰性對(duì)照(GW9662)及陽(yáng)性對(duì)照(rosiglitazone)，

5、用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)處理后胞內(nèi)脂聯(lián)素、PPARγ及Cdk5基因表達(dá)，觀察胞內(nèi)脂聯(lián)素、PPARγ及Cdk5基因表達(dá)變化及脂聯(lián)素與PPARγ、Cdk5的相互關(guān)系。
　　2.用100及400μmol/L的EPA、DHA、α-ALA、AA、LA、OA、PA處理3T3-L1成熟脂肪細(xì)胞，收集胞內(nèi)蛋白后，用Western-blot法檢測(cè)胞內(nèi)脂聯(lián)素、PPARγ及Cdk5的蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量，觀察受試后各組胞內(nèi)脂聯(lián)素、PPARγ及Cdk5蛋白

6、的變化。
　　3.用100μmol/L的EPA、DHA、α-ALA、AA、 LA、OA、PA處理3T3-L1成熟脂肪細(xì)胞后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，用Westem-blot法檢測(cè)培養(yǎng)液中脂聯(lián)素蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量，觀察胞外脂聯(lián)素蛋白表達(dá)的變化。
　　4.所得數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±S）表示，采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS19.0進(jìn)行分析。如果方差齊，組間比較采用單因素方差分析(One Way ANOVA)，兩兩比較采用LSD T-test

7、或dunnett T-test;如果方差不齊，運(yùn)用Welch法和Dunnett's T3法分別進(jìn)行組間比較和兩兩比較。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。P＜0.05為差異顯著。
　　結(jié)果:
　　1.不同濃度的n-3多不飽和脂肪酸對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞胞內(nèi)脂聯(lián)素、PPARγ及Cdk5基因表達(dá)的影響
　　(1)不同濃度的DHA對(duì)脂聯(lián)素、PPARγ及Cdk5基因表達(dá)的影響
　　脂肪細(xì)胞經(jīng)不同濃度的DHA處理后，其2

8、5、50、100、200μmol/L濃度組都上調(diào)胞內(nèi)脂聯(lián)素和PPARγ基因相對(duì)表達(dá)量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，其中100μmol/L濃度組對(duì)脂聯(lián)素基因表達(dá)的上調(diào)作用最為顯著。400μmol/L濃度組抑制脂聯(lián)素及PPARγ mRNA表達(dá)(P＜0.01);100μmol/L濃度組上調(diào)Cdk5基因表達(dá)(P＜0.05)，400μmol/L濃度組下調(diào)Cdk5基因相對(duì)表達(dá)量(P＜0.05)。
　　(2)不同濃度的EPA對(duì)脂聯(lián)素、PP

9、ARγ及Cdk5基因表達(dá)的影響
　　脂肪細(xì)胞經(jīng)不同濃度的EPA處理后，其對(duì)脂聯(lián)素、PPARγ基因相對(duì)表達(dá)的影響，在25～200μmol/L濃度組均表現(xiàn)為促進(jìn)作用，其中200μmol/L濃度組對(duì)脂聯(lián)素及PPARγ基因表達(dá)的促進(jìn)作用最為顯著(P＜0.05）;在50～200μmol/L濃度范圍可升高Cdk5基因相對(duì)表達(dá)量(P＜0.05);400μmol/L濃度組抑制脂聯(lián)素mRNA表達(dá)量(P＜0.01)，此時(shí)PPARγ及Cdk5 mRNA

10、相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著變化(P＞0.05)。
　　(3)不同濃度的α-ALA對(duì)脂聯(lián)素、PPARγ及Cdk5基因表達(dá)的影響
　　脂肪細(xì)胞經(jīng)不同濃度的α-ALA處理后，其50、100μmol/L濃度組的脂聯(lián)素基因相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組顯著增加(P＜0.05)，以100μmol/L濃度組最為明顯;濃度為25、50μmol/L時(shí)，PPARγ基因相對(duì)表達(dá)量顯著增加(P＜0.05);400μmol/L濃度組的脂聯(lián)素及PPARγ基因相對(duì)表達(dá)量均明顯

11、減少（P＜0.05）。不同濃度處理組的α-ALA對(duì)Cdk5基因相對(duì)表達(dá)量均無(wú)顯著影響。
　　2.不同濃度的n-6多不飽和脂肪酸對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞胞內(nèi)脂聯(lián)素、PPARγ及Cdk5基因表達(dá)的影響
　　(1)不同濃度的AA對(duì)脂聯(lián)素、PPARγ及Cdk5基因表達(dá)的影響。
　　(2)不同濃度的LA對(duì)脂聯(lián)素、PPARγ及Cdk5基因表達(dá)的影響。
　　3.不同濃度的單不飽和脂肪酸OA對(duì)脂聯(lián)素、PPARγ及Cdk5基因表達(dá)的

12、影響
　　4.不同濃度的飽和脂肪酸PA對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞胞內(nèi)脂聯(lián)素、PPARγ及Cdk5基因表達(dá)的影響
　　5.不同類型脂肪酸（100及400μmol/L）對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞胞內(nèi)脂聯(lián)素、PPARγ及Cdk5蛋白表達(dá)的影響
　　6.不同類型脂肪酸(100μmol/L)對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞胞外脂聯(lián)素蛋白表達(dá)的影響
　　7.胞內(nèi)脂聯(lián)素、PPARγ及Cdk5相關(guān)性分析
　　結(jié)論:
　　1.不同濃度的

13、脂肪酸對(duì)脂聯(lián)素表達(dá)的影響中以100umol/L組對(duì)脂聯(lián)素的促進(jìn)作用最明顯，400umol/L組對(duì)脂聯(lián)素的抑制作用最明顯。
　　2.一定濃度范圍內(nèi)(25～100umol/L)，與n-6PUFAs相比，n-3PUFA、單不飽和脂肪酸OA更能促進(jìn)脂聯(lián)素的表達(dá)，而飽和脂肪酸PA對(duì)脂聯(lián)素的促進(jìn)作用僅在低濃度25umol/L時(shí)起作用。
　　3.n-3PUFAs(DHA、EPA、α-ALA)中，濃度為100umol/L時(shí)，以DHA對(duì)脂聯(lián)素

14、的促進(jìn)作用最強(qiáng)。
　　4.n-6PUFAs(AA、LA)中，AA僅在較低濃度(25umol/L)時(shí)促進(jìn)脂聯(lián)素表達(dá)，而LA在100umol/L時(shí)對(duì)脂聯(lián)素表達(dá)的促進(jìn)作用最強(qiáng)。
　　5.不同類型的脂肪酸(100、400umol/L)作用下胞內(nèi)脂聯(lián)素基因及蛋白表達(dá)與PPARγ基因及蛋白表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系(P＜0.05);Cdk5基因表達(dá)與脂聯(lián)素、PPARγ基因表達(dá)無(wú)相關(guān)關(guān)系，但Cdk5蛋白表達(dá)與脂聯(lián)素、PPARγ蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(