樹豆酮酸A抑制3T3-L1脂肪細(xì)胞分化及調(diào)控其脂質(zhì)代謝的作用研究.pdf

1、目的:
　　樹豆酮酸A（cajanonicacidA，CAA）是從樹豆葉中分離出來的一種新的蔗類化合物。前期研究發(fā)現(xiàn)，CAA具有降糖降脂作用。本實(shí)驗(yàn)以小鼠3T3-L1前脂肪細(xì)胞為模型，以期進(jìn)一步研究CAA對(duì)脂肪細(xì)胞分化和脂肪代謝的作用，并探討其調(diào)控機(jī)制。
　　方法:
　　(1)CAA對(duì)3T3-L1細(xì)胞增殖的影響:不同濃度CAA作用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的3T3-L1細(xì)胞48h，CCK8法檢測(cè)細(xì)胞活力。(2)CAA對(duì)3T3-L1細(xì)胞

2、成脂分化的作用:對(duì)3T3-L1細(xì)胞進(jìn)行成脂分化誘導(dǎo)，同時(shí)加入不同濃度CAA，油紅O染色法檢測(cè)細(xì)胞分化程度及脂質(zhì)合成。(3)CAA對(duì)脂肪細(xì)胞脂質(zhì)代謝的作用:3T3-L1細(xì)胞被誘導(dǎo)分化為成熟脂肪細(xì)胞后，加入不同濃度CAA作用48h后測(cè)定細(xì)胞總脂質(zhì)、甘油三酯含量，以及細(xì)胞培養(yǎng)上清甘油和游離脂肪酸含量。(4)CAA對(duì)脂肪細(xì)胞分化調(diào)控基因的作用:對(duì)3T3-L1細(xì)胞進(jìn)行成脂分化誘導(dǎo)同時(shí)加入不同濃度CAA，分別在第0-8天提取總RNA，實(shí)時(shí)熒光定量P

3、CR法檢測(cè)分化調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子及其靶基因的表達(dá)。(5)CAA對(duì)JAK2/STAT3信號(hào)通路的作用:CAA作用誘導(dǎo)分化成熟的3T3-L1脂肪細(xì)胞48h，收集總RNA與總蛋白，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法與Westernblot法檢測(cè)JAK2、STAT3及下游基因的表達(dá)及磷酸化水平。(6)CAA對(duì)AMPK信號(hào)通路的作用:CAA作用于誘導(dǎo)分化成熟的3T3-L1脂肪細(xì)胞48h，收集總RNA與總蛋白，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法與Westernblot法檢測(cè)AMPK

4、及其下游基因的表達(dá)及磷酸化水平。
　　結(jié)果:
　　(1)CAA在25-200μmol/L的濃度范圍內(nèi)對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞的增殖活性無顯著性影響(P＞0.05)。(2)在CAA50、100、150μmol/L濃度作用下，3T3L1細(xì)胞的成脂分化程度顯著下降(P＜0.05，P＜0.01)，分化率分別為74.48％、46.47％、19.71％。(3)CAA在25-100μmol/L濃度范圍內(nèi)顯著抑制成熟脂肪細(xì)胞脂質(zhì)合成(P＜0

5、.05，P＜0.01)，在CAA最高劑量組（100μmol/L）中，3T3L1細(xì)胞總脂質(zhì)和甘油三酯含量比對(duì)照組降低約32％和24％;同時(shí)CAA也顯著抑制成熟脂肪細(xì)胞的脂肪分解(P＜0.05，P＜0.01)，在CAA最高劑量組（100μmol/L）中，脂肪細(xì)胞游離脂肪酸和甘油釋放量比對(duì)照組降低約32％和30％。(4)在脂肪細(xì)胞分化過程中，CAA劑量依賴性明顯下調(diào)脂肪細(xì)胞分化調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子C/EBPα、ADD1、PPARγ以及其相應(yīng)的靶基因L

6、PL、AP2、FAS、ACC、Adiponectin、ResistinmRNA水平(P＜0.05，P＜0.01)。(5)CAA下調(diào)JAK2和STAT3磷酸化水平。進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，JAK2/STAT3下游靶基因--PPARγ的mRNA和蛋白水平也隨之下調(diào)。(6)CAA上調(diào)AMPK磷酸化水平，激活A(yù)MPK信號(hào)通路:ACC的表達(dá)受到抑制，磷酸化水平提高，活性下降;與脂肪合成相關(guān)的基因(FAS)、與脂肪酸吸收相關(guān)的基因(LPL)以及與脂肪水解相

7、關(guān)的基因(HSL)的表達(dá)水平下降;與脂肪酸氧化相關(guān)的基因（ACOX、CPT-1）mRNA水平上調(diào)。(7)CAA在100μmol/L濃度下顯著促進(jìn)瘦素分泌(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　(1)CAA可有效抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞成脂分化，有效抑制脂質(zhì)合成，并顯著減少FFA的釋放。(2)CAA通過下調(diào)脂肪細(xì)胞分化調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子及其靶基因表達(dá)，從而抑制脂肪細(xì)胞成脂分化。(3)CAA可能通過抑制JAK2/STAT3通路，下調(diào)脂肪