3T3-L1脂肪細胞胰島素抵抗相關(guān)miRNAs的篩選及功能研究.pdf

1、第一部分miRNAs在3T3-L1脂肪細胞和胰島素抵抗脂肪細胞中的差異表達 目的： 1.探討正常3T3-L1脂肪細胞和胰島素抵抗（insulinresistance，IR）脂肪細胞中微小RNA（miRNAs）的表達是否存在差異。 2.篩選幾個可能與IR相關(guān)的miRNAs，尋找其靶基因，以進一步研究miRNAs在IR中的作用。 方法： 1.IR脂肪細胞模型的建立：采用高糖/高胰島素處理3T3-L1脂

2、肪細胞24小時，通過葡萄糖消耗實驗和[3H]葡萄糖攝取實驗判斷模型是否建立。 2.miRNAs的差異表達：運用miRNAs芯片技術(shù)檢測3T3-L1脂肪細胞和IR脂肪細胞中差異表達的miRNAs。 3.IR相關(guān)的幾個miRNAs及其靶基因的篩選：根據(jù)基因芯片結(jié)果，對顯著變化的某些miRNAs進行分析，篩選幾個可能與IR相關(guān)的miRNAs及其調(diào)控的靶基因。 結(jié)果： 1.IR脂肪細胞模型的建立高糖/高胰島素分別

3、使3T3-L1脂肪細胞葡萄糖消耗量和[3H]葡萄糖攝取率下降75％和161％，與脂肪細胞組相比差異有顯著性，結(jié)果表明IR脂肪細胞模型成立。 2.miRNAs芯片分析miRNAs芯片結(jié)果顯示：miRNAs在IR脂肪細胞中比在脂肪細胞中表達水平升高2倍以上者有50個，表達水平降低至1/2以下者有29個；且miR-320上調(diào)最明顯，miR-21下調(diào)最明顯。 3.IR相關(guān)的幾個miRNAs及其靶基因應(yīng)用生物信息學方法，我們選取了

4、3個可能與IR相關(guān)的miRNAs（miR-320，298和miR-21）進行下一步的功能實驗，Pik3r1可能是他們的靶基因。 結(jié)論： 1.高糖和高胰島素可誘導3T3-L1脂肪細胞產(chǎn)生IR。 2.脂肪細胞和IR脂肪細胞中存在miRNAs的差異表達。 第二部分miRNAs對3T3-L1脂肪細胞胰島素抵抗的調(diào)節(jié)作用及其分子機制 目的： 1.針對miR-320和miR-298設(shè)計相應(yīng)的反義寡核苷

5、酸（AMO-miR-320，AMO-miR-298），同時構(gòu)建含miR-21前體的重組質(zhì)粒（pSilencer3.1-miR-21）。以脂質(zhì)體為載體介導，觀察AMO-miR-320，AMO-miR-298及pSilencer3.1-miR-21對3T3-L1脂肪細胞和IR脂肪細胞糖代謝的影響。了解這3個miRNAs在正常和病理狀況下有無促進葡萄糖攝取和改善IR的作用。 2.對能改善脂肪細胞IR的miRNAs，進一步探討其作用機制

6、。 方法： 1.miRNAs對正常及IR脂肪細胞葡萄糖消耗的影響。 2.miRNAs對正常及IR脂肪細胞葡萄糖攝取的影響。 3.miRNAs對IR脂肪細胞PI-3K、Akt、GLUT4的表達和GLUT4轉(zhuǎn)位的影響。 結(jié)果： 1.miRNAs對正常3T3-L1脂肪細胞葡萄糖消耗和攝取的影響：基礎(chǔ)狀態(tài)下，3種miRNAs對3T3-L1脂肪細胞葡萄糖消耗和攝取無顯著性影響；在100nmol/L胰

7、島素存在的條件下，各組脂肪細胞對葡萄糖的消耗和攝取都顯著增加，分別是基礎(chǔ)狀態(tài)下的2.2-2.3倍和4.2-4.4倍，但組間無顯著性差異。 2.miRNAs對IR脂肪細胞葡萄糖消耗和攝取的影響：基礎(chǔ)狀態(tài)下，IR組和脂肪細胞組葡萄糖消耗量和攝取率無顯著性差異。在100nmol/L胰島素存在下，與脂肪細胞組相比，IR組葡萄糖消耗量和攝取率顯著下降；與IR組比較，AMO-miR-320+IR組和pSilencer3.1-miR-21+I

8、R組葡萄糖消耗量分別增加了18.5％和14.9％（P<0.05），葡萄糖攝取率分別增加了57.3％和46.2％（P<0.05）；其他各組與IR組相比，葡萄糖消耗量和攝取率無顯著性差異。 3.miRNAs對IR脂肪細胞PI-3K、Akt、GLUT4的表達和GLUT4轉(zhuǎn)位的影響：Western-blot顯示：與脂肪細胞組相比，IR組PI3Kp85蛋白表達和Akt絲氨酸磷酸化水平分別下降了42.7％和54.8％；AMO-miR-320

9、和miR-21可完全恢復(fù)IR脂肪細胞PI3Kp85表達；同時使IR脂肪細胞Akt絲氨酸磷酸化水平分別提高28.5％和33.9％。此外，IR組較脂肪細胞組GLUT4蛋白表達顯著下降51.1％， 結(jié)論： 1.AMO-miR-320和miR-21可促進IR脂肪細胞糖代謝、改善IR。 2.AMO-miR-320和miR-21可能是通過作用PI3KP85和PI3KP85上游基因，提高Akt絲氨酸磷酸化水平，促進GLUT4的

10、轉(zhuǎn)位來發(fā)揮改善IR的作用。 第三部分脂肪細胞分化過程中miRNAs差異表達及功能研究 目的： 1.探討3T3-L1前脂肪細胞和間質(zhì)干細胞（MSC）分化成脂肪細胞過程中差異表達的miRNAs。 2.觀察miR-320、miR-21和miR-375對3T3-L1脂肪細胞分化的影響；對能影響脂肪細胞分化的miRNAs，進一步探討其作用機制。 方法： 1.脂肪細胞分化過程中miRNAs的差異表達。

11、 2.脂肪細胞分化相關(guān)的miRNAs的篩選及其靶基因的預(yù)測。 3.miR-21和miR-375對3T3-L1前脂肪細胞分化的影響。 4.AMO-miR-320對3T3-L1前脂肪細胞分化的影響。 5.miR-375促進3T3-L1前脂肪細胞的分化及可能機制。 結(jié)果： 1.miRNAs芯片分析：誘導分化結(jié)束時，兩種脂肪細胞內(nèi)均含許多脂滴，90％以上的細胞能被油紅O染色；且PPARγ2和aP2

12、的基因表達顯著增加，這些結(jié)果表明3T3-L1前脂肪細胞和MSC分化成成熟的脂肪細胞。芯片結(jié)果顯示：3T3-L1前脂肪細胞分化成脂肪細胞上調(diào)的miRNAs有26個，下調(diào)的miRNAs有2個：小鼠MSC分化成脂肪細胞上調(diào)的miRNAs有20個，下調(diào)的miRNAs有55個。 2.脂肪細胞分化相關(guān)的miRNAs及其靶基因：應(yīng)用生物信息學方法，選擇了3個可能與脂肪細胞分化相關(guān)的miRNAs（miR-320，21和miR-375），且MAP

13、K1（ERK2）可能是這3個miRNAs的靶基因。 3.miRNAs對3T3-L1前脂肪細胞分化的影響：油紅O染色結(jié)果表明：miR-375顯著增加脂肪細胞的OD值，而miR-21和AMO-miR-320對脂肪細胞的OD值無顯著影響，提示miR-375能促進3T3-L1前脂肪細胞分化。 4.miR-375促進3T3-L1前脂肪細胞的分化及可能機制：RT-PCR結(jié)果表明：對照組和miR375組在分化過程中PPARγ2和aP2