急性血清淀粉樣蛋白A對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞胰島素敏感性的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、炎癥因子SAA是否通過(guò)激活胰島素作用靶細(xì)胞的JNK活性而介導(dǎo)IR的呢？目前國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)此方面的報(bào)道，我們將對(duì)此進(jìn)行初步探討。 本課題以3T3-L1前脂肪細(xì)胞為研究載體，胰島素抵抗為研究的切入點(diǎn)，探索脂肪源性炎癥因子SAA與胰島素抵抗的關(guān)系及SAA介導(dǎo)胰島素抵抗的可能機(jī)制。以期為胰島素抵抗和2型糖尿病的防治提供更多的理論支持。具體研究?jī)?nèi)容分為三章。 第一章:急性血清淀粉樣蛋白A在3T3-L1脂肪細(xì)胞的表達(dá)和胰島素抵抗的關(guān)系

2、研究 [目的]: 通過(guò)觀察A-SAA在胰島素敏感脂肪細(xì)胞和胰島素抵抗脂肪細(xì)胞的表達(dá)，探討A-SAA與胰島素抵抗的關(guān)系。 [方法]: 1.3T3-L1前脂肪細(xì)胞加入誘導(dǎo)分化劑8～10天后，90%以上呈脂肪細(xì)胞表型，可用于實(shí)驗(yàn)。 2.建立脂肪細(xì)胞胰島素抵抗模型：將成熟的脂肪細(xì)胞分別暴露于三種不同濃度的TNF-α（1μg/L、10μg/L、20μg/L）、三種不同濃度的地塞米松（10nmol/L、100

3、nmol/L、1000nmol/L）中培養(yǎng)48小時(shí)，建立抵抗程度不同的細(xì)胞胰島素抵抗模型。在Washout試驗(yàn)中，20μg/LTNF-α和1000nmol/L地塞米松分別加入脂肪細(xì)胞中培養(yǎng)48小時(shí)后，移出含TNF-α和地塞米松的培養(yǎng)液，換入普通培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)12小時(shí)后行葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)。 3.采用3H-2-脫氧葡萄糖（3H-2-DG）攝入法檢測(cè)脂肪細(xì)胞對(duì)葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)率。其中，基礎(chǔ)狀態(tài)下葡萄糖攝?。ɑA(chǔ)率）是指無(wú)胰島素時(shí)細(xì)胞對(duì)3H

4、-2-DG的攝取率。胰島素刺激率是指胰島素刺激后細(xì)胞對(duì)3H-2-DG的攝取率。將對(duì)照組胰島素刺激率設(shè)為100%，所有值以該值為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行計(jì)算，以各組3H-2-DG攝入減少量來(lái)反映胰島素的抵抗程度。 4.采用RT-PCR法檢測(cè)SAA3mRNA的表達(dá)，ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞上清液A-SAA蛋白含量。 5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用各組的均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包行單因素方差分析（One-Way

5、 ANOVA），進(jìn)一步多重比較采用LSD法。檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)為α＝0.05。 [結(jié)果]: 1.脂肪細(xì)胞形態(tài)變化3T3-L1前脂肪細(xì)胞呈典型的梭形，胞漿中無(wú)脂滴，形態(tài)與成纖維細(xì)胞相似。誘導(dǎo)分化第8～10天，90%以上的細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞漿豐富，含有大量的脂滴，部分細(xì)胞可見(jiàn)脂滴分布于核周?chē)?，形成“戒環(huán)樣”結(jié)構(gòu)，為典型的成熟脂肪細(xì)胞形態(tài)，油紅0染色后脂滴著紅色。 2.TNF-α對(duì)細(xì)胞葡萄糖攝取的影響與對(duì)照組比，5μg/L、10μg

6、/L和20μg/LTNF-α作用各組分別使葡萄糖攝取率減少了25%（P<0.01）、43%（P<0.01）、58%（P<0.01）；進(jìn)一步多重比較顯示，10μg/L TNF-α組與5μg/L TNF-α組（P<0.01）、20μg/L TNF-α組與5μg/L TNF-α組（P<0.01）、20μg/L TNF-α組與10μg/L TNF-α組（P<0.01）的葡萄糖攝取均有顯著性差異。 3.地塞米松對(duì)細(xì)胞葡萄糖攝取的影響與對(duì)照

7、組比，10nmol/L、100nmol/L和1000nmol/L地塞米松作用各組分別使葡萄糖攝取率減少了15%（P<0.05）、40%（P<0.01）、55%（P<0.01）；進(jìn)一步多重比較顯示，100nmol/L地米組與10nmol/L地米組（P<0.01），1000nmol/L地米組與10nmol/L地米組（P<0.01），1000nmol/L地米組與100nmol/L地米組（P<0.01）的葡萄糖攝取均有顯著性差異。 [結(jié)

8、論]: 1.地塞米松和TNF-α均能在體外成功的建立脂肪細(xì)胞胰島素抵抗模型。且在一定時(shí)間內(nèi)，地塞米松和TNF-α均以劑量依賴(lài)方式影響脂肪細(xì)胞的胰島素抵抗程度。 2.胰島素敏感的3T3-LI脂肪細(xì)胞SAA3mRNA和A-SAA蛋白只有少量表達(dá)，胰島素抵抗的3T3-LI脂肪細(xì)胞的SAA3 mRNA和A-SAA蛋白表達(dá)量顯著增加，其表達(dá)量隨著細(xì)胞胰島素抵抗程度的增加而增加。提示A-SAA與胰島素抵抗有密切的關(guān)系，可能是反應(yīng)胰島

9、素抵抗的一個(gè)生物學(xué)指標(biāo)。 第二章:重組人血清淀粉樣蛋白A對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞胰島素敏感性的影響 [目的]: 通過(guò)檢測(cè)不同濃度和不同時(shí)間點(diǎn)重組人血清淀粉樣蛋白A（Rh-SAA）干預(yù)的3T3-LI脂肪細(xì)胞對(duì)葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)情況，了解Rh-SAA對(duì)脂肪細(xì)胞胰島素敏感性的影響。 [方法]: 1.采用三種不同濃度的Rh-SAA（1μg/ml，10μg/ml，20μg/ml）干預(yù)3T3-LI脂肪細(xì)胞48小時(shí)，同

10、時(shí)以無(wú)Rh-SAA干預(yù)的細(xì)胞為對(duì)照組。各組細(xì)胞處理完畢后分別行葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)。 2.20μg/ml Rh-SAA分別干預(yù)細(xì)胞6h、12h、24h、48h；同時(shí)以Rh-SAA干預(yù)前的細(xì)胞（0h）為對(duì)照組，各組細(xì)胞處理完畢后分別行葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)。 3.在Washout試驗(yàn)中，將20μg/ml Rh-SAA加入脂肪細(xì)胞中培養(yǎng)48小時(shí)，移出含Rh-SAA的培養(yǎng)液，換入普通培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)12小時(shí)后行葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)。 4.

11、采用3H-2-DG攝入法檢測(cè)細(xì)胞對(duì)葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)率。其中，基礎(chǔ)狀態(tài)下葡萄糖攝取率（基礎(chǔ)率）是指無(wú)胰島素時(shí)細(xì)胞對(duì)3H-2-DG的攝取率。胰島素刺激率是指胰島素刺激后細(xì)胞對(duì)3H-2-DG的攝取率。將對(duì)照組胰島素刺激率設(shè)為100%，所有值以該值為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行計(jì)算，以各組3H-2-DG攝入減少量來(lái)反映胰島素的抵抗程度。 5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：同第一章。 [結(jié)論]: 1.Rh-SAA對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞基礎(chǔ)狀態(tài)下葡萄糖攝取無(wú)明顯影響

12、。 2.小劑量Rh-SAA（1μg/ml）對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞胰島素的敏感性無(wú)明顯影響，中等劑量Rh-SAA（10μg/ml）和大劑量Rh-SAA（20μg/ml）能明顯減弱脂肪細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性。且Rh-SAA以濃度依賴(lài)方式誘導(dǎo)3T3-L1脂肪細(xì)胞產(chǎn)生胰島素抵抗。 3. Rh-SAA短時(shí)間（12h內(nèi)）作用對(duì)脂肪細(xì)胞胰島素敏感性無(wú)明顯影響，作用24h后明顯減弱細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性，且以時(shí)間依賴(lài)方式誘導(dǎo)3T3-L1脂肪

13、細(xì)胞誘導(dǎo)胰島素抵抗。 第三章:重組人血清淀粉樣蛋白A介導(dǎo)3T3-L1脂肪細(xì)胞胰島素抵抗的機(jī)制研究 [目的]: 通過(guò)檢測(cè)Rh-SAA對(duì)3T3-LI脂肪細(xì)胞的JNK活化、IRS-1酪氨酸磷酸化程度及GLUT4蛋白表達(dá)的調(diào)控，初步探討Rh-SAA介導(dǎo)胰島素抵抗的機(jī)制。 [方法]: 1.實(shí)驗(yàn)分組及細(xì)胞培養(yǎng)：共分3組（各組均為3復(fù)孔），第一組為無(wú)Rh-SAA干預(yù)的對(duì)照組（以下稱(chēng)對(duì)照組），第二組為20μg/m

14、l Rh-SAA干預(yù)脂肪細(xì)胞組（以下稱(chēng)Rh-SAA組），第三組在20μg/ml Rh-SAA干預(yù)前12小時(shí)，予以JNK抑制劑SP60012550μM預(yù)處理（以下稱(chēng)JNK抑制劑組），培養(yǎng)48小時(shí)后行葡萄糖攝取和免疫印跡檢測(cè)。當(dāng)檢測(cè)IRS-1、GLUT4和PY-IRS-1時(shí)，在蛋白抽提前予以100nmol胰島素作用10分鐘。 2.采用3H-2-DG攝入法檢測(cè)細(xì)胞對(duì)葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)率。 3.采用免疫印跡（Wersterm blot

15、ting）檢測(cè)各組細(xì)胞的JNK、p-JNK、IRS-1總蛋白表達(dá)和GLUT4蛋白表達(dá)。采用免疫沉淀和免疫印跡檢測(cè)IRS-1的酪氨酸磷酸化（PY-IRS-1）程度。 4.免疫沉淀和免疫印跡結(jié)果分析：將膠片進(jìn)行圖像掃描后，用Gel Pro Analyzer軟件分析蛋白區(qū)帶，將p-JNK蛋白條帶與JNK蛋白條帶的灰度比值作為p-JNK蛋白的相對(duì)表達(dá)量；將PY-IRS-1蛋白條帶與IRS-1蛋白條帶的灰度比值作為PV-IRS-1蛋白的相

16、對(duì)表達(dá)量；將GLUT4蛋白條帶與內(nèi)參β-actin蛋白條帶的灰度比值作為GLUT4蛋白的相對(duì)表達(dá)量，將對(duì)照組目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量設(shè)為100%，所有值以該值為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行計(jì)算。 5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：同第一章。 [結(jié)論]: 1.Rh-SAA能活化3T3-L1脂肪細(xì)胞的JNK信號(hào)通路。 2.JNK抑制劑能部分恢復(fù)Rh-SAA所致的胰島素抵抗，提示Rh-SAA介導(dǎo)的胰島素抵抗與JNK通路激活有關(guān)。 3.Rh-SA

17、A能降低3T3-L1脂肪細(xì)胞IRS-1的酪氨酸磷酸化，此作用能被JNK抑制劑部分恢復(fù)。提示Rh-SAA介導(dǎo)的胰島素抵抗與胰島素信號(hào)傳遞通路中關(guān)鍵分子IRS-1受損有關(guān)，JNK的活化可能是Rh-SAA導(dǎo)致胰島素信號(hào)傳遞受損的關(guān)鍵原因之一。也支持了JNK是聯(lián)系炎癥與胰島素抵抗的重要橋梁。 4.Rh-SAA能減少3T3-L1脂肪細(xì)胞GLUT4蛋白的表達(dá)，表明Rh-SAA介導(dǎo)脂肪細(xì)胞胰島素抵抗的機(jī)制之一可能是其導(dǎo)致GLUT4蛋白表達(dá)的降