脂聯(lián)素球狀結(jié)構(gòu)域(gAd)改善3T3-L1脂肪細(xì)胞胰島素抵抗的效果與機(jī)制研究.pdf

1、目的
　　 探討脂聯(lián)素球狀結(jié)構(gòu)域(globular domain of adiponectin,gAd)改善3T3-L1脂肪細(xì)胞胰島素抵抗的效果及其可能的機(jī)制。
　　 方法
　　 復(fù)蘇凍存的3T3-L1前脂肪細(xì)胞株,置37℃細(xì)胞孵育箱中,5％CO2條件下培養(yǎng)并誘導(dǎo)分化為成熟的3T3-L1脂肪細(xì)胞,用細(xì)胞形態(tài)學(xué)及油紅O染色法鑒定細(xì)胞。用梯度透析法復(fù)性原核基因重組的gad蛋白,用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定gad蛋白含量。用軟脂

2、酸(Plamoticacid,PA)制備3T3-LI脂肪細(xì)胞胰島素抵抗(insulin resisitent,IR)模型。用不同濃度gad(250 ng／mL、500 ng／mL、1000 ng／mL)干預(yù)已產(chǎn)生IR的脂肪細(xì)胞5h,設(shè)空白對(duì)照組,用葡萄糖氧化酶法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液葡萄糖含量,用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)各組3T3-L1脂肪細(xì)胞IRS-1、PI-3K、PKB、GLUT-4、AMPK、CPT-I的mRNA表達(dá)水平。用Western b

3、lot檢測(cè)AMPK Thr-172及IRS-1磷酸化水平。用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件建立數(shù)據(jù)庫(kù)分析數(shù)據(jù),數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示,檢驗(yàn)水準(zhǔn)取a=0.05。
　　 結(jié)果
　　 1.3T3-L1脂肪細(xì)胞IR模型的制備
　　 不同濃度的PA(0.25 mmol／L、0.5 mmol／L、1.0 mmol／L)作用于分化成熟的3T3-L1脂肪細(xì)胞24h可抑制葡萄糖的攝取,與對(duì)照組相比各實(shí)驗(yàn)組葡萄糖攝取率

4、分別下降5.25％、10.29％、14.54％。說(shuō)明PA具有引起3T3-L1脂肪細(xì)胞產(chǎn)生IR的作用,且1.0 mmol／L PA作用于3T3-L1細(xì)胞24h抑制細(xì)胞葡萄糖攝取的效果最顯著。
　　 2.gAd對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞IR模型葡萄糖攝取能力的影響
　　 不同濃度的gAd(250 ng／mL、500 ng／mL、1000 ng／mL)作用于產(chǎn)生IR的3T3-L1脂肪細(xì)胞,可促進(jìn)脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取(F=35.499

5、,r=-0.883,P=0.005)。與對(duì)照組相比,gAd250 ng／mL時(shí)就可顯著促進(jìn)脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取(p=0.000)。
　　 3.gAd對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞IR模型AMPK通路的影響
　　 gAd可增加3T3-L1脂肪細(xì)胞IR模型AMPK(F=359.374,r=0.986,P=0.000)、CPT—I(F=180.234,r=0.973,P=0.000)基因的表達(dá),呈劑量依賴(lài)關(guān)系。各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較均有顯

6、著差異(P<0.01),各實(shí)驗(yàn)組組間比較也有顯著差異(P<0.01)。Western blot結(jié)果顯示,gAd可增加3T3-L1脂肪細(xì)胞IR模型AMPK Thr-172磷酸化水平,且隨著gAd濃度的增加,AMPK Thr-172磷酸化水平逐漸增強(qiáng)(F=269.407,r=0.982,P=0.000)。
　　 4.gAd對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞IR模型胰島素PI-3K途徑的影響
　　 與對(duì)照組相比,250 ng／mL gAd

7、組可增加3T3-L1脂肪細(xì)胞IR模型GLUT-4mRNA的表達(dá)(P=0.024),但I(xiàn)RS-1(P=0.324)、PI-3K(P=0.125)、PKB(P=0.748)mRNA表達(dá)較對(duì)照組無(wú)顯著差異；500 ng／mL gAd組IRS-1(P=0.031)、PI-3K(P=0.002)、PKB(P=0.01)、GLUT-4(P=0.000)的表達(dá)均比對(duì)照組顯著增加,且PI-3K(t=-3.66 P=0.022)、PKB(t=-4.161

8、P=0.014)、GLUT-4(t=-15.039,P=0.000)的表達(dá)均較250 ng／mL gAd組顯著增加；1000 ng／mLgAd組IRS-1(P=0.031)、PI-3K(P=0.000)、PKB(P=0.000)、GLUT-4(P=0.000)的表達(dá)均比對(duì)照組顯著增加,且GLUT-4(t=10.483,P=0.000)mRNA的表達(dá)較500 ng／mL gAd組顯著增加。Western blot結(jié)果顯示,gAd可增加3T

9、3-L1脂肪細(xì)胞IR模型IRS-1磷酸化水平,且隨著gAd濃度的增加,IRS-1磷酸化水平逐漸增加(F=360.345,r=0.968,P=0.000)。
　　 結(jié)論
　　 1.gAd可促進(jìn)3T3-L1脂肪細(xì)胞IR模型葡萄糖的攝取。
　　 2.gAd可能是通過(guò)促進(jìn)AMPK Thr-172磷酸化,激活A(yù)MPK,增加CPT-I的活性,促進(jìn)脂肪酸的氧化,改善3T3-L1脂肪細(xì)胞的IR。
　　 3.gAd可增加胰