骨鈣素對小鼠3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化的影響及通過Sirt2-FoxO1通路改善胰島素抵抗機(jī)制的研究.pdf

1、[目的]
　　觀察骨鈣素對小鼠3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化的影響及對下游分子FoxO1、Sirt2、GLUT4和脂聯(lián)素的影響，探討骨鈣素通過Sirt2/FoxO1通路控制肥胖、改善胰島素抵抗的機(jī)制。
　　[方法]
　　將3T3-L1細(xì)胞接種到24孔培養(yǎng)板中，加入含有10％胎牛血清高糖DMEM的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37℃、5％CO2、飽和濕度條件下孵育。當(dāng)細(xì)胞接觸抑制2d后加入誘導(dǎo)劑，其中含有10μg/ml胰島素、1μmol/L

2、地塞米松、0.5mmol/L IBMX。首先實(shí)驗(yàn)設(shè)置a組為空白組，b、c、d組每孔分別加入100pg/ml、1ng/ml、10ng/ml骨鈣素，每組6孔，每48h換液一次，在誘導(dǎo)分化后第12天后用ELISA法檢測各組中FoxO1、Sirt2的水平以篩選較佳骨鈣素濃度。得出較佳濃度后另外設(shè)置骨鈣素組為A組，無藥物干預(yù)組為B組，骨鈣素及SGK2干預(yù)組為C組，每組6孔。實(shí)驗(yàn)期間B組按前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化培養(yǎng)步驟培養(yǎng)，A組每孔加入較佳濃度的骨鈣素

3、，C組每孔加入較佳濃度骨鈣素及1000μM的SGK2。每2d換液一次，每3d照相一次，在誘導(dǎo)分化后的第12天，用油紅O將細(xì)胞染色，觀察細(xì)胞的形態(tài)變化及細(xì)胞內(nèi)的脂肪含量變化，照相后提取油紅O染色液用分光光度計(jì)510nm波長處測量OD值。并用ELISA及Real-Time PCR法檢測各組中FoxO1、Sirt2、GLUT4和脂聯(lián)素在3T3-L1前脂肪細(xì)胞中的表達(dá)。
　　[結(jié)果]
　　1.實(shí)驗(yàn)第一步得出骨鈣素的較佳濃度為10ng

4、/ml。骨鈣素和Sirt2(p＜0.05)及FoxO1(p＜0.001)具有正相關(guān)關(guān)系。
　　2.骨鈣素對小鼠3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化的影響:B組細(xì)胞在加入誘導(dǎo)劑后第2天，細(xì)胞體積變大，局部細(xì)胞出現(xiàn)小膨出。然后膨出的體積及數(shù)目逐漸增大、增多，細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見小脂滴。隨著分化的進(jìn)展，第6天胞質(zhì)內(nèi)的脂滴開始增多，細(xì)胞形態(tài)由多邊形變?yōu)閳A形或橢圓形，并出現(xiàn)脂滴融合現(xiàn)象，至第12天，細(xì)胞核被推向細(xì)胞邊緣，分化成成熟的脂肪細(xì)胞。A組細(xì)胞在分化

5、開始第3天起可見細(xì)胞膜局部有少量的小膨出，第6天可見細(xì)胞內(nèi)有少量小脂滴，第9天一部分細(xì)胞變成圓形，細(xì)胞內(nèi)脂滴較前稍增大，數(shù)目也較前稍增多。至第12天成熟脂肪細(xì)胞數(shù)目增多。相比較，B組細(xì)胞第2天開始細(xì)胞已發(fā)生形態(tài)變化，第6天即可見富含脂滴的成熟脂肪細(xì)胞，而在分化第12天成熟的脂肪細(xì)胞數(shù)目明顯高于A組。油紅O染色后OD值示，A組OD值明顯低于B組(p＜0.01)。
　　3.骨鈣素對小鼠3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化過程中FoxO1、Sir

6、t2、GLUT4和脂聯(lián)素的影響:ELISA檢測結(jié)果顯示，與B組相比，A組細(xì)胞中FoxO1、Sirt2、GLUT4和脂聯(lián)素水平明顯升高(p＜0.001)，Real-Time PCR檢測可見A組細(xì)胞中FoxO1(p＜0.001)、 Sirt2(p＜0.001)、GLUT4(p＜0.05)和脂聯(lián)素(p＜0.001)的mRNA表達(dá)量均較B組升高。
　　4.Sirt2抑制劑SGK2對骨鈣素刺激下3T3-L1前脂肪細(xì)胞FoxO1、GLUT4和

7、脂聯(lián)素的變化:ELISA檢測結(jié)果顯示，與A組相比，在加入Sirt2抑制劑SGK2后，C組細(xì)胞中FoxO1、 Sirt2、GLUT4和脂聯(lián)素水平明顯降低(p＜0.001)，Real-Time PCR檢測可見C組細(xì)胞中FoxO1(p＜0.001)、Sirt2(p＜0.001)、GLUT4(p＜0.05)和脂聯(lián)素(p＜0.001)的mRNA表達(dá)量較A組降低。C組細(xì)胞亦于分化的第2天開始發(fā)生形態(tài)變化，第6天可見富含脂滴的成熟脂肪細(xì)胞，第12天成