TRPM7在壓力超負(fù)荷下小鼠心肌纖維化形成中的作用.pdf

1、高血壓(Hypertension)是最常見的心血管疾病，由于發(fā)病率較高已成為全球范圍重要的公共健康問(wèn)題。長(zhǎng)期高血壓的患者會(huì)發(fā)生代償性的心肌肥厚(Cardiachypertrophy)，最終導(dǎo)致心功能障礙和心力衰竭，其發(fā)生與心肌重構(gòu)(Myocardialremodeling，MR)密切相關(guān)。臨床觀察和實(shí)驗(yàn)室研究證明，心肌纖維化(Myocardialfibrosis)是心肌重構(gòu)的重要病理表現(xiàn)之一，也是造成心力衰竭的主要原因。因此，明確心肌纖

2、維化的發(fā)生機(jī)制，將有利于尋找新的治療靶點(diǎn)，對(duì)臨床防治心臟疾病具有重要意義。
　　 心肌成纖維細(xì)胞(Cardiac fibroblasts，CFs)是心肌纖維化產(chǎn)生的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。在某些病理因素如心肌損傷、缺氧應(yīng)激、機(jī)械牽拉、炎性刺激等作用下，心肌成纖維細(xì)胞會(huì)過(guò)度增殖、遷移和發(fā)生表型轉(zhuǎn)變，分化成為肌纖維母細(xì)胞(Myofibroblasts，MFB)。肌纖維母細(xì)胞通過(guò)分泌細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(Extracellular-matrix，ECM

3、)、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞介素、趨化因子和蛋白酶等，對(duì)纖維化的形成起著重要作用。然而，關(guān)于調(diào)控心肌成纖維細(xì)胞分化，進(jìn)而促進(jìn)纖維化形成的分子機(jī)制還不清楚。
　　 Ca2+信號(hào)參與細(xì)胞的多種功能，包括細(xì)胞的增殖、分化、基因表達(dá)、細(xì)胞的凋亡等。研究表明，在心肌成纖維細(xì)胞上并不存在功能性電壓依賴性Ca2+離子通道，這與其靜息膜電位(-20 mV)下電壓門控離子通道處于失活狀態(tài)有關(guān)，提示非電壓門控的Ca2+通道可能對(duì)心肌成纖維細(xì)胞的生理功能起主導(dǎo)

4、作用。瞬時(shí)感受器電位(Transient receptor potential，TRP)通道是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的非電壓門控性離子通道，能被多種刺激所激活，包括氧化應(yīng)激、機(jī)械牽拉、細(xì)胞代謝產(chǎn)物、熱刺激等。TRPM7(Transient receptor potential melastatin related7)通道是TRP家族成員之一，廣泛存在于機(jī)體的組織器官中，參與細(xì)胞的增殖和分化、運(yùn)動(dòng)和遷移、胚胎的發(fā)育、氧化應(yīng)激反應(yīng)以及細(xì)胞的凋亡等。最近

5、的研究發(fā)現(xiàn)，在人類心房肌成纖維細(xì)胞上，TRPM7通道是對(duì)Ca2+通透的主要的功能性離子通道，并且參與心房肌成纖維細(xì)胞的增殖、分化和膠原的生成。由此我們推測(cè)，TRPM7可能參與心肌成纖維細(xì)胞的促纖維化作用。
　　 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(Transforming growth factor beta-1，TGF-β1)是體內(nèi)促進(jìn)心肌纖維化的重要細(xì)胞因子之一，研究表明，TGF-β1具有促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞向肌纖維母細(xì)胞分化、促進(jìn)膠原基因表

6、達(dá)、ECM合成與沉積等作用。而細(xì)胞內(nèi)Ca2+信號(hào)是TGF-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中重要的第二信使，使用Ca2+通道阻滯劑能夠部分抑制TGF-β1介導(dǎo)的心肌纖維化形成。TRPM7通道作為心肌成纖維細(xì)胞上主要的功能性Ca2+離子通道，很可能與TGF-β1介導(dǎo)的心肌纖維化過(guò)程相關(guān)聯(lián)。
　　 神經(jīng)鞘脂類(Sphingolipids)分子是細(xì)胞膜的一個(gè)重要組成成分，同時(shí)在細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。神經(jīng)鞘脂類分子主要包括神經(jīng)酰胺(Cer

7、amide，Cer)、神經(jīng)鞘氨醇(Sphingosine，SPH)、1-磷酸神經(jīng)鞘氨醇(Sphingosine1-phophate，S1P)等。它們參與細(xì)胞的多種生物學(xué)過(guò)程，被稱作“具有生物活性的脂類”。最新的研究發(fā)現(xiàn)，某些神經(jīng)鞘脂類分子對(duì)TRP通道家族中的一些成員具有調(diào)節(jié)作用。因此我們推測(cè)神經(jīng)鞘脂類分子可能對(duì)TRPM7通道也有調(diào)節(jié)作用。
　　 為明確心肌纖維化的發(fā)生機(jī)制，本研究通過(guò)主動(dòng)脈弓縮窄術(shù)(Transverse Aort

8、icConstriction，TAC)模擬和建立壓力超負(fù)荷(高血壓)致小鼠心肌纖維化模型，采用心臟超聲、免疫組織化學(xué)方法、電生理學(xué)方法、鈣比率熒光成像技術(shù)以及基因敲除等多種分子生物學(xué)技術(shù)，探討TRPM7在心肌纖維化形成中的作用和潛在的分子機(jī)制以及內(nèi)源性的神經(jīng)鞘磷脂分子及其結(jié)構(gòu)類似物對(duì)TRPM7通道活性的影響，以期為臨床上心肌纖維化的治療尋求新的干預(yù)靶點(diǎn)和新藥開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 實(shí)驗(yàn)材料和方法
　　 將20只雄性C5

9、7BL/6小鼠(8-10周齡)隨機(jī)分為TAC模型組和假手術(shù)組，每組10只，運(yùn)用心臟超聲監(jiān)測(cè)各實(shí)驗(yàn)條件下小鼠心功能變化情況。于術(shù)后8周處死小鼠切取心臟，檢測(cè)心臟及肺臟的重量，計(jì)算心臟肥厚指數(shù)和肺重量指數(shù)。通過(guò)HE染色方法觀察心臟結(jié)構(gòu)變化；采用苦味酸.天狼猩紅膠原染色(Picro-siriusred)檢測(cè)心肌纖維化程度并計(jì)算心肌膠原容積分?jǐn)?shù)(Cardiac collegen volumefraction，CVF)；通過(guò)Western blo

10、t檢測(cè)心肌組織中TRPM7蛋白表達(dá)水平。
　　 另將20只TRPM7基因敲除(TRPM7-/-)小鼠和20只野生型(WT)小鼠分別隨機(jī)分為TAC模型組和假手術(shù)組，即TRPM7-/-TAC組、TRPM7-/-Sham組、WT-TAC組和WT-Sham組，每組10只。分離和培養(yǎng)小鼠心室肌成纖維細(xì)胞，采用鈣比率熒光顯像技術(shù)測(cè)量WT模型組和WT假手術(shù)組小鼠心肌成纖維細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度；膜片鉗(全細(xì)胞)檢測(cè)心肌成纖維細(xì)胞TRPM7通道電流

11、變化。在通過(guò)PCR方法和Western Blot方法確認(rèn)TRPM7基因敲除的基礎(chǔ)上，運(yùn)用前述的相關(guān)實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)各組小鼠心肌肥厚和心功能變化情況、心肌纖維化程度、TRPM7蛋白及TGFβ1蛋白表達(dá)水平。
　　 以穩(wěn)定高表達(dá)TRPM7通道的293-TRPM7細(xì)胞和人類及小鼠心肌成纖維細(xì)胞為研究對(duì)象，通過(guò)膜片鉗技術(shù)檢測(cè)內(nèi)源性的神經(jīng)鞘脂類分子及其結(jié)構(gòu)類似物一神經(jīng)鞘氨醇(SPH)、1-磷酸神經(jīng)鞘氨醇(S1P)、神經(jīng)酰胺(Ceramide)

12、、二甲基鞘氨醇(DMS)和芬戈莫德(FTY720)等對(duì)TRPM7通道活性的影響。
　　 結(jié)果
　　 1、術(shù)后8周，超聲心動(dòng)圖結(jié)果顯示：TAC組小鼠左心室壁厚度、左室內(nèi)徑均顯著高于Sham組(P<0.01)；左室射血分?jǐn)?shù)和縮短分?jǐn)?shù)均明顯低于Sham組(P<0.01)。HE染色顯示：TAC組小鼠心肌細(xì)胞體積明顯增大，心肌細(xì)胞間距明顯增寬，心肌肥厚指數(shù)顯著增加(P<0.01)?？辔端?天狼猩紅心肌膠原染色顯示：TAC組小鼠心肌

13、膠原容積分?jǐn)?shù)明顯升高(P<0.01)。Western Blot方法檢測(cè)結(jié)果顯示：TRPM7通道蛋白在TAC組小鼠纖維化心肌中表達(dá)上調(diào)(P<0.05)。
　　 2、術(shù)后8周，與WT-Sham組相比，WT-TAC組小鼠心肌成纖維細(xì)胞的Ca2+內(nèi)流顯著增加(P<0.05)、同時(shí)檢測(cè)到TRPM7通道電流幅度明顯增大(P<0.05)。與WT-TAC組相比，TRPM7-/-TAC組小鼠心肌肥厚程度減輕，心臟泵功能也明顯強(qiáng)于WT-TAC組(P

14、<0.01)。TRPM7-/-TAC組小鼠心肌組織中膠原形成減少，并且其心肌成纖維細(xì)胞TGFβ1蛋白表達(dá)量也減少。
　　 3、細(xì)胞外液分別灌流1μM的SPH、DMS和FTY720能夠完全阻斷HEK-293細(xì)胞的TRPM7通道電流，其IC50分別為0.59μM、0.3μM和0.72μM；而鞘磷脂分子Ceramides、SIP和SPH結(jié)構(gòu)類似物FTY720-P對(duì)TRPM7通道的活性無(wú)明顯作用。同樣，SPH、DMS和FTY720對(duì)TR

15、PM7通道電流的抑制作用在人類心房肌成纖維細(xì)胞和小鼠心肌成纖維細(xì)胞上也得到證明。
　　 結(jié)論
　　 1、在采用主動(dòng)脈弓縮窄術(shù)(TAC)制作的壓力超負(fù)荷小鼠模型中，檢測(cè)出心臟泵功能減弱，出現(xiàn)了心室肌肥厚、心肌纖維化。
　　 2、TRPM7通道蛋白在小鼠纖維化心肌中表達(dá)水平升高。TRPM7通道可能通過(guò)增強(qiáng)介導(dǎo)Ca2+內(nèi)流，促進(jìn)心肌纖維化的形成。其中，調(diào)節(jié)心肌成纖維細(xì)胞TGF-β1表達(dá)是其作用機(jī)制之一。