半乳糖凝集素-3在壓力超負(fù)荷心力衰竭小鼠心室重構(gòu)發(fā)生發(fā)展中的作用.pdf

1、目的:半乳糖凝集素-3(Galectin-3)作為一種炎性反應(yīng)介質(zhì)，在介導(dǎo)心室重構(gòu)中起著重要作用。心室重構(gòu)是心力衰竭(Congestive HeartFailure，CHF)發(fā)展的基礎(chǔ)，是臨床結(jié)局的重要決定因素，與CHF的進展和不良預(yù)后相關(guān)。本研究通過改良微創(chuàng)主動脈弓縮窄方法建立壓力超負(fù)荷CHF小鼠模型，觀察隨著CHF的發(fā)生發(fā)展，小鼠心肌組織Galectin-3表達(dá)水平的改變，探討其在壓力超負(fù)荷CHF小鼠模型心室重構(gòu)及CHF發(fā)生發(fā)展中的

2、作用。
　　方法:
　　1.主動脈弓縮窄術(shù)CHF模型建立及動物分組:體重18-24克的雄性昆明小鼠，動物稱重后，腹腔注射戊巴比妥25mg.kg-1行全身麻醉，左側(cè)第一肋間隙緊鄰胸骨左緣切口入胸，剝離主動脈弓，將6-0無損傷絲線套于主動脈弓第一分支（無名動脈）以及第二分支（左頸總動脈）之間，之后將主動脈弓及25 G（直徑0.5 mm）注射器針頭一并牢固結(jié)扎，待結(jié)扎牢固后小心抽離針頭，即可形成針頭直徑大小的主動脈弓縮窄。仔細(xì)探查

3、止血后，負(fù)壓關(guān)胸。待小鼠蘇醒后，裝籠飼養(yǎng)，正常飲食;在主動脈弓相同部位套線但不結(jié)扎血管，余同上，建立假手術(shù)組模型。
　　2.心臟超聲檢查:于術(shù)前及術(shù)后8周分別對小鼠行經(jīng)胸心臟超聲檢查。小鼠麻醉后，剃除前胸部毛發(fā)，于胸骨旁乳頭肌水平短軸切面收集主動脈血流情況及左心室二維圖像。同時采集二維引導(dǎo)下10個連續(xù)心動周期的M型超聲心動圖紀(jì)錄。測量左心室收縮期前、后壁厚度(Aws、Pws)、舒張期前、后壁厚度(Awd、Pwd)、左心室舒張末期內(nèi)

4、徑(LVEDd)、左心室舒張末期外徑(EXLVDd)、左心室收縮末期內(nèi)徑(LVESd.)和短軸縮短率(FS)。所有測量工作均由有經(jīng)驗的醫(yī)師在同一彩超儀上完成，每個指標(biāo)均由兩位醫(yī)師在10個連續(xù)心動周期中觀測取平均值。其中左心室短軸縮短率(FS％)計算公式:FS％=[(LVEDD-LVESD)/LVEDD]×100。
　　3.血液動力學(xué)指標(biāo)測定:術(shù)后8周，小鼠稱重、麻醉后，切開小鼠的右頸總動脈，將超微型心導(dǎo)管經(jīng)切口插入左心室內(nèi)。連接N

5、ikon4多導(dǎo)生理記錄儀，對小鼠的各項血液動力學(xué)指標(biāo)進行測定，包括左心室舒張末期壓(LVEDP)、左心室收縮壓(LVSP)、左心室壓力變化最大速率(+dp/dtmax和-dp/dtmax)。測得各項指標(biāo)后，斷頸處死小鼠，取出心臟，沖洗干凈并去除大血管、心臟外結(jié)締組織、心房及右心室，稱量左心室(LV)重量（包括室間隔）并計算左心室重量/體重比值，即左心室肥厚指數(shù)(LVHI)，單位為mg/g。
　　4.組織病理學(xué)檢測:心室組織標(biāo)本病理

6、切片HE及MASSON染色，并用顯微圖像分析系統(tǒng)測量心肌膠原容積百分比(CVF)，心肌膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF)=心肌膠原纖維面積/所測視野面積。同時應(yīng)用兔抗-Galectin-3多抗進行免疫組織化學(xué)檢測。
　　5.實時熒光定量PCR(Real-time PCR)方法檢測心肌組織Galectin-3 mRNA、膠原纖維Ⅰ mRNA、膠原纖維Ⅲ mRNA的表達(dá):使用異硫氰酸肌-苯酚-氯仿一步法提取心肌組織中的mRNA，按照MMVL一步法

7、RT-PCR試劑盒（沈陽海靈興業(yè)商貿(mào)有限公司）提供的說明書加人RT-PCR反應(yīng)所需的各種試劑:Taq酶、引物、RNA樣品、無菌雙蒸水至終體積30ul，逆轉(zhuǎn)錄條件為38℃，30min;PCR反應(yīng)條件:95℃15 min，94℃15S，60℃30S，72℃45 S，以上為1個循環(huán)。循環(huán)45次后，最后72℃再延伸10 min。引物由沈陽海靈興業(yè)商貿(mào)有限公司合成，Galectin-3:上游引物:5'-TGG AGC ACT AAT CAG GT

8、GAGC-3'，下游引物:5'-TGA AGC GGG GGT TAA AGT GG-3';膠原纖維Ⅰ:上游引物:5'-TCC CGT CTT TGG GGG TTG-3'，下游引物:5'-CCA AAG AAG ACA TCC CTG AAG-3';膠原纖維Ⅲ:上游引物:5'-CTG GGG CAC CAG GAG AAC-3'，下游引物:5'-CCA AGA AGACAT CCC TGA AG-3';GAPDH:上游引物:5'-TA

9、T CGG ACG CCT GGTTAC-3'，下游引物:5'-CGT TCA AGT TGC CGT GTC-3'。將反應(yīng)體系置于SLAN熒光定量PCR儀中，采用相對定量的方法，以GAPDH基因mRNA的表達(dá)為內(nèi)參基因，依據(jù)公式△Ct=Ct（目的基因）—Ct（內(nèi)參基因），分別計算出實驗組和對照組的△Ct，再依公式△△Ct=△Ct（實驗組）一△Ct（對照組）計算出△△Ct值，最后計算2-△△Ct，即相對表達(dá)量的差值，2-△△Ct的意義是

10、實驗組的目的基因的表達(dá)相對于對照組的變化倍數(shù)。
　　6.Western-Blot方法檢測心肌組織Galectin-3蛋白:將左心室心肌組織稱量后提取心肌蛋白質(zhì)樣品，采用BCA法測定蛋白濃度后，點樣于SDS-PAGE凝膠中進行電泳，然后轉(zhuǎn)膜，封閉，抗體雜交，ECL發(fā)光并進行凝膠成像分析系統(tǒng)檢測。條帶對應(yīng)蛋白質(zhì)含量=（樣品條帶的光密度×面積）/(GAPDH的光密度×面積)。
　　7.數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析:所有試驗數(shù)據(jù)采用SPSS18.0

11、軟件進行統(tǒng)計處理。連續(xù)性資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，組間比較采用Student'st-test。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.術(shù)后小鼠存活情況及死亡原因:弓縮窄組30只建立CHF模型中，術(shù)后24小時存活21只，手術(shù)成功率(70％)，死亡9只(30％)。小鼠死亡大多發(fā)生在實驗開始階段，因技術(shù)不熟練，在主動脈剝離過程中操作失誤導(dǎo)致主動脈損傷或破裂出血。3只小鼠于術(shù)后3周內(nèi)因急性CHF死亡，8周

12、存活率85.7％(18/21)。假手術(shù)組術(shù)后未見死亡。主動脈弓縮窄組小鼠毛發(fā)無光澤，均出現(xiàn)不同程度的口唇鼻尖發(fā)紺，呼吸急促，食量及活動明顯減少，眼瞼分泌物增多。
　　2.小鼠左心室形態(tài)各參數(shù)變化:與假手術(shù)組比較，弓縮窄組EXLVDD、Aws、Awd、Pws、Pwd明顯增加(p＜0.05); LVEDD、LVFS顯著降低(p＜0.05)。
　　3.小鼠血流動力學(xué)各參數(shù)變化:術(shù)后8周，弓縮窄組LVEDP較假手術(shù)組增加(6.4±1

13、.8 vs4.6±0.8，P＜0.05)，而LVSP和±dp/dtmax明顯下降(LVSP:93.4±4.5 vs111.4±2.5;+dp/dtmax:5214.5±464.9 vs7400.5±208.2;-dp/dtmax:5120.8±240.6 vs6468.5±209.6，P＜0.05)，說明模型制備成功。
　　4.組織病理學(xué)檢測:弓縮窄組小鼠體重下降，LV質(zhì)量增加，且VLHI較假手術(shù)組明顯增加(5.2±0.3 vs3

14、.1±0.2，P＜0.05)。光鏡下可見弓縮窄組肌纖維排列紊亂，部分區(qū)域肌纖維溶解，心肌細(xì)胞水腫、肥大、局灶壞死，細(xì)胞數(shù)目減少，細(xì)胞核大小不均一，小血管壁增厚，大量藍(lán)綠色膠原纖維包繞分割心肌細(xì)胞，間質(zhì)增生伴炎性細(xì)胞浸潤。與假手術(shù)組相比較，弓縮窄組MASSON染色心室CVF明顯增加（12.02±0.71 vs2.56±0.42，P＜0.05）。免疫組織化學(xué)檢測，弓縮窄組小鼠心肌Galectin-3的表達(dá)明顯增強，且在心肌纖維化區(qū)域更為顯著

15、。
　　5.實時熒光定量PCR(Real-time PCR)方法檢測心肌組織Galectin-3 mRNA、膠原纖維Ⅰ mRNA、膠原纖維Ⅲ mRNA的表達(dá):采用相對定量的方法，以GAPDH基因mRNA的表達(dá)為內(nèi)參基因，結(jié)果以弓縮窄組目的基因的表達(dá)相對于假手術(shù)組的變化倍數(shù)表示。兩組Galectin-3 mRNA相對表達(dá)水平，與假手術(shù)組比較，弓縮窄組高，其相對表達(dá)量相比具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異（1.67±0.08 vs0.83±0.06，

16、P＜0.05）;兩組膠原纖維Ⅰ mRNA相對表達(dá)水平，與假手術(shù)組比較，弓縮窄組高，其相對表達(dá)量相比具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(1.35±0.03 vs0.38±0.02，P＜0.05);兩組膠原纖維Ⅲ mRNA相對表達(dá)水平，與假手術(shù)組比較，弓縮窄組高，其相對表達(dá)量相比具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(0.46±0.07 vs0.24±0.04，P＜0.05);兩組Ⅰ/Ⅲ膠原相對表達(dá)水平比值相比，弓縮窄組顯著高于假手術(shù)組(2.88±0.76 vs1.62±0.

17、56，P＜0.05)。
　　6.心肌組織Galectin-3蛋白的Western-Blot檢測:采用Western-Blot方法檢測心肌組織Galectin-3蛋白質(zhì)含量:相對于假手術(shù)組，弓縮窄組心肌組織Galectin-3蛋白表達(dá)明顯增高(1.48±0.07 vs0.74±0.05 P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.改良微創(chuàng)主動脈弓縮窄方法可以成功建立和臨床上壓力超負(fù)荷狀態(tài)所誘發(fā)的CHF病理生理過程相似的CHF動