半乳糖凝集素-3在壓力超負(fù)荷心力衰竭小鼠心室重構(gòu)發(fā)生發(fā)展中的作用.pdf

1、目的:半乳糖凝集素-3(Galectin-3)作為一種炎性反應(yīng)介質(zhì)，在介導(dǎo)心室重構(gòu)中起著重要作用。心室重構(gòu)是心力衰竭(Congestive HeartFailure，CHF)發(fā)展的基礎(chǔ)，是臨床結(jié)局的重要決定因素，與CHF的進(jìn)展和不良預(yù)后相關(guān)。本研究通過改良微創(chuàng)主動(dòng)脈弓縮窄方法建立壓力超負(fù)荷CHF小鼠模型，觀察隨著CHF的發(fā)生發(fā)展，小鼠心肌組織Galectin-3表達(dá)水平的改變，探討其在壓力超負(fù)荷CHF小鼠模型心室重構(gòu)及CHF發(fā)生發(fā)展中的

2、作用。
　　方法:
　　1.主動(dòng)脈弓縮窄術(shù)CHF模型建立及動(dòng)物分組:體重18-24克的雄性昆明小鼠，動(dòng)物稱重后，腹腔注射戊巴比妥25mg.kg-1行全身麻醉，左側(cè)第一肋間隙緊鄰胸骨左緣切口入胸，剝離主動(dòng)脈弓，將6-0無損傷絲線套于主動(dòng)脈弓第一分支（無名動(dòng)脈）以及第二分支（左頸總動(dòng)脈）之間，之后將主動(dòng)脈弓及25 G（直徑0.5 mm）注射器針頭一并牢固結(jié)扎，待結(jié)扎牢固后小心抽離針頭，即可形成針頭直徑大小的主動(dòng)脈弓縮窄。仔細(xì)探查

3、止血后，負(fù)壓關(guān)胸。待小鼠蘇醒后，裝籠飼養(yǎng)，正常飲食;在主動(dòng)脈弓相同部位套線但不結(jié)扎血管，余同上，建立假手術(shù)組模型。
　　2.心臟超聲檢查:于術(shù)前及術(shù)后8周分別對小鼠行經(jīng)胸心臟超聲檢查。小鼠麻醉后，剃除前胸部毛發(fā)，于胸骨旁乳頭肌水平短軸切面收集主動(dòng)脈血流情況及左心室二維圖像。同時(shí)采集二維引導(dǎo)下10個(gè)連續(xù)心動(dòng)周期的M型超聲心動(dòng)圖紀(jì)錄。測量左心室收縮期前、后壁厚度(Aws、Pws)、舒張期前、后壁厚度(Awd、Pwd)、左心室舒張末期內(nèi)

4、徑(LVEDd)、左心室舒張末期外徑(EXLVDd)、左心室收縮末期內(nèi)徑(LVESd.)和短軸縮短率(FS)。所有測量工作均由有經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)師在同一彩超儀上完成，每個(gè)指標(biāo)均由兩位醫(yī)師在10個(gè)連續(xù)心動(dòng)周期中觀測取平均值。其中左心室短軸縮短率(FS％)計(jì)算公式:FS％=[(LVEDD-LVESD)/LVEDD]×100。
　　3.血液動(dòng)力學(xué)指標(biāo)測定:術(shù)后8周，小鼠稱重、麻醉后，切開小鼠的右頸總動(dòng)脈，將超微型心導(dǎo)管經(jīng)切口插入左心室內(nèi)。連接N

5、ikon4多導(dǎo)生理記錄儀，對小鼠的各項(xiàng)血液動(dòng)力學(xué)指標(biāo)進(jìn)行測定，包括左心室舒張末期壓(LVEDP)、左心室收縮壓(LVSP)、左心室壓力變化最大速率(+dp/dtmax和-dp/dtmax)。測得各項(xiàng)指標(biāo)后，斷頸處死小鼠，取出心臟，沖洗干凈并去除大血管、心臟外結(jié)締組織、心房及右心室，稱量左心室(LV)重量（包括室間隔）并計(jì)算左心室重量/體重比值，即左心室肥厚指數(shù)(LVHI)，單位為mg/g。
　　4.組織病理學(xué)檢測:心室組織標(biāo)本病理

6、切片HE及MASSON染色，并用顯微圖像分析系統(tǒng)測量心肌膠原容積百分比(CVF)，心肌膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF)=心肌膠原纖維面積/所測視野面積。同時(shí)應(yīng)用兔抗-Galectin-3多抗進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測。
　　5.實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR)方法檢測心肌組織Galectin-3 mRNA、膠原纖維Ⅰ mRNA、膠原纖維Ⅲ mRNA的表達(dá):使用異硫氰酸肌-苯酚-氯仿一步法提取心肌組織中的mRNA，按照MMVL一步法

7、RT-PCR試劑盒（沈陽海靈興業(yè)商貿(mào)有限公司）提供的說明書加人RT-PCR反應(yīng)所需的各種試劑:Taq酶、引物、RNA樣品、無菌雙蒸水至終體積30ul，逆轉(zhuǎn)錄條件為38℃，30min;PCR反應(yīng)條件:95℃15 min，94℃15S，60℃30S，72℃45 S，以上為1個(gè)循環(huán)。循環(huán)45次后，最后72℃再延伸10 min。引物由沈陽海靈興業(yè)商貿(mào)有限公司合成，Galectin-3:上游引物:5'-TGG AGC ACT AAT CAG GT

8、GAGC-3'，下游引物:5'-TGA AGC GGG GGT TAA AGT GG-3';膠原纖維Ⅰ:上游引物:5'-TCC CGT CTT TGG GGG TTG-3'，下游引物:5'-CCA AAG AAG ACA TCC CTG AAG-3';膠原纖維Ⅲ:上游引物:5'-CTG GGG CAC CAG GAG AAC-3'，下游引物:5'-CCA AGA AGACAT CCC TGA AG-3';GAPDH:上游引物:5'-TA

9、T CGG ACG CCT GGTTAC-3'，下游引物:5'-CGT TCA AGT TGC CGT GTC-3'。將反應(yīng)體系置于SLAN熒光定量PCR儀中，采用相對定量的方法，以GAPDH基因mRNA的表達(dá)為內(nèi)參基因，依據(jù)公式△Ct=Ct（目的基因）—Ct（內(nèi)參基因），分別計(jì)算出實(shí)驗(yàn)組和對照組的△Ct，再依公式△△Ct=△Ct（實(shí)驗(yàn)組）一△Ct（對照組）計(jì)算出△△Ct值，最后計(jì)算2-△△Ct，即相對表達(dá)量的差值，2-△△Ct的意義是

10、實(shí)驗(yàn)組的目的基因的表達(dá)相對于對照組的變化倍數(shù)。
　　6.Western-Blot方法檢測心肌組織Galectin-3蛋白:將左心室心肌組織稱量后提取心肌蛋白質(zhì)樣品，采用BCA法測定蛋白濃度后，點(diǎn)樣于SDS-PAGE凝膠中進(jìn)行電泳，然后轉(zhuǎn)膜，封閉，抗體雜交，ECL發(fā)光并進(jìn)行凝膠成像分析系統(tǒng)檢測。條帶對應(yīng)蛋白質(zhì)含量=（樣品條帶的光密度×面積）/(GAPDH的光密度×面積)。
　　7.數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析:所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS18.0

11、軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。連續(xù)性資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，組間比較采用Student'st-test。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.術(shù)后小鼠存活情況及死亡原因:弓縮窄組30只建立CHF模型中，術(shù)后24小時(shí)存活21只，手術(shù)成功率(70％)，死亡9只(30％)。小鼠死亡大多發(fā)生在實(shí)驗(yàn)開始階段，因技術(shù)不熟練，在主動(dòng)脈剝離過程中操作失誤導(dǎo)致主動(dòng)脈損傷或破裂出血。3只小鼠于術(shù)后3周內(nèi)因急性CHF死亡，8周

12、存活率85.7％(18/21)。假手術(shù)組術(shù)后未見死亡。主動(dòng)脈弓縮窄組小鼠毛發(fā)無光澤，均出現(xiàn)不同程度的口唇鼻尖發(fā)紺，呼吸急促，食量及活動(dòng)明顯減少，眼瞼分泌物增多。
　　2.小鼠左心室形態(tài)各參數(shù)變化:與假手術(shù)組比較，弓縮窄組EXLVDD、Aws、Awd、Pws、Pwd明顯增加(p＜0.05); LVEDD、LVFS顯著降低(p＜0.05)。
　　3.小鼠血流動(dòng)力學(xué)各參數(shù)變化:術(shù)后8周，弓縮窄組LVEDP較假手術(shù)組增加(6.4±1

13、.8 vs4.6±0.8，P＜0.05)，而LVSP和±dp/dtmax明顯下降(LVSP:93.4±4.5 vs111.4±2.5;+dp/dtmax:5214.5±464.9 vs7400.5±208.2;-dp/dtmax:5120.8±240.6 vs6468.5±209.6，P＜0.05)，說明模型制備成功。
　　4.組織病理學(xué)檢測:弓縮窄組小鼠體重下降，LV質(zhì)量增加，且VLHI較假手術(shù)組明顯增加(5.2±0.3 vs3

14、.1±0.2，P＜0.05)。光鏡下可見弓縮窄組肌纖維排列紊亂，部分區(qū)域肌纖維溶解，心肌細(xì)胞水腫、肥大、局灶壞死，細(xì)胞數(shù)目減少，細(xì)胞核大小不均一，小血管壁增厚，大量藍(lán)綠色膠原纖維包繞分割心肌細(xì)胞，間質(zhì)增生伴炎性細(xì)胞浸潤。與假手術(shù)組相比較，弓縮窄組MASSON染色心室CVF明顯增加（12.02±0.71 vs2.56±0.42，P＜0.05）。免疫組織化學(xué)檢測，弓縮窄組小鼠心肌Galectin-3的表達(dá)明顯增強(qiáng)，且在心肌纖維化區(qū)域更為顯著

15、。
　　5.實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR)方法檢測心肌組織Galectin-3 mRNA、膠原纖維Ⅰ mRNA、膠原纖維Ⅲ mRNA的表達(dá):采用相對定量的方法，以GAPDH基因mRNA的表達(dá)為內(nèi)參基因，結(jié)果以弓縮窄組目的基因的表達(dá)相對于假手術(shù)組的變化倍數(shù)表示。兩組Galectin-3 mRNA相對表達(dá)水平，與假手術(shù)組比較，弓縮窄組高，其相對表達(dá)量相比具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（1.67±0.08 vs0.83±0.06，

16、P＜0.05）;兩組膠原纖維Ⅰ mRNA相對表達(dá)水平，與假手術(shù)組比較，弓縮窄組高，其相對表達(dá)量相比具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(1.35±0.03 vs0.38±0.02，P＜0.05);兩組膠原纖維Ⅲ mRNA相對表達(dá)水平，與假手術(shù)組比較，弓縮窄組高，其相對表達(dá)量相比具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(0.46±0.07 vs0.24±0.04，P＜0.05);兩組Ⅰ/Ⅲ膠原相對表達(dá)水平比值相比，弓縮窄組顯著高于假手術(shù)組(2.88±0.76 vs1.62±0.

17、56，P＜0.05)。
　　6.心肌組織Galectin-3蛋白的Western-Blot檢測:采用Western-Blot方法檢測心肌組織Galectin-3蛋白質(zhì)含量:相對于假手術(shù)組，弓縮窄組心肌組織Galectin-3蛋白表達(dá)明顯增高(1.48±0.07 vs0.74±0.05 P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.改良微創(chuàng)主動(dòng)脈弓縮窄方法可以成功建立和臨床上壓力超負(fù)荷狀態(tài)所誘發(fā)的CHF病理生理過程相似的CHF動(dòng)