TBHQ改善壓力超負荷小鼠心肌重構(gòu)的作用及其機制研究.pdf

1、本文主要從以下幾方面進行了論述：
　?、?TBHQ改善壓力超負荷小鼠心肌重構(gòu)的作用及其機制研究
　　目的：
　　1.研究TBHQ對壓力超負荷小鼠心肌重構(gòu)過程的影響
　　2.研究TBHQ改善壓力超負荷心肌重構(gòu)的可能機制
　　方法：
　　1.實驗動物分組
　　2.動物模型建立
　　3.超聲心動圖檢測
　　4.組織病理學和免疫組織化學檢測
　　5.羥脯氨酸檢測
　　6.蛋白質(zhì)免

2、疫印跡
　　7.蛋白質(zhì)羰基化檢測
　　8.TUNEL染色
　　9.實時定量PCR反應
　　10.Akt酶活性和Nrf2活性檢測
　　11.肝臟組織血紅蛋白含量檢測
　　12.統(tǒng)計學分析
　　結(jié)果：
　　1.TBHQ處理降低了TAC導致的死亡率
　　2.依據(jù)心臟超聲檢測結(jié)果，TAC術后2周小鼠的左心室壁顯著增厚，但左心室腔維持正常，即發(fā)生代償性心肌肥厚。TAC術后4周發(fā)生失代償性心肌肥

3、厚、心力衰竭，左心室腔擴張，心室壁變薄。我們觀察到，TBHQ處理抑制了TAC引起的左心室擴張及心室壁變薄。2周時TAC組和Sham組小鼠的射血分數(shù)(EF)和短軸縮短率(FS)無顯著差異，然而，4周時TAC組的EF和FS顯著降低。TBHQ處理逆轉(zhuǎn)了TAC引起的EF和FS的損害。
　　另外，我們發(fā)現(xiàn)4周時TAC組的肺臟重量較Sham組顯著增加，TAC組肝臟血紅蛋白含量較Sham組顯著升高，而TBHQ處理顯著降低肝臟血紅蛋白含量。

4、>　　3.結(jié)果顯示，TBHQ處理并不影響TAC引起的心肌纖維化程度。
　　4.結(jié)果顯示，TBHQ未能顯著改變左心室組織Nrf2靶基因的表達水平。但是，TBHQ卻使小鼠肝腎組織的Nrf2靶基因表達水平顯著升高。
　　另外，我們還發(fā)現(xiàn)心臟組織AMPKα的磷酸化水平未受TBHQ影響。而且，TBHQ處理亦未顯著影響ER應激標志CHOP和GRP78的mRNA表達水平。
　　5.通過心臟左室組織切片的TUNEL染色，我們觀察到，T

5、AC組心肌細胞凋亡水平較Sham組顯著增加了近10倍。TBHQ處理顯著抑制TAC導致的心肌細胞凋亡水平近60％。
　　6.結(jié)果顯示TBHQ處理組的Akt1和Akt2的磷酸化水平均顯著增高。
　　7.TAC術后2周，TAC+LY294002組的左室收縮功能顯著降低，心肌肥厚被顯著抑制。但是，TBHQ并不能改善TAC+LY294002組的心功能異常。TAC組心肌組織中的p-Akt水平較Sham組顯著升高。另外，Sham組和TAC

6、組的心肌細胞凋亡水平無顯著差異。與TAC組比較，TAC+LY294002組心肌組織的p-Akt水平顯著降低，細胞凋亡水平顯著增加。而TBHQ并未能逆轉(zhuǎn)這一變化。
　　TAC術后2周，TAC+Rapamycin組的心肌肥厚指標較TAC組顯著降低。TAC術后4周，TAC+Rapamycin組的FS和EF值較TAC組有所改善。同時，TBHQ可以進一步改善TAC+Rapamycin組的左室收縮功能。
　　8.發(fā)現(xiàn)TAC組心肌組織中的

7、羰基化蛋白豐度顯著升高，而TBHQ處理顯著抑制TAC誘導的蛋白質(zhì)羰基化水平。
　　結(jié)論：
　　1.TBHQ顯著改善壓力超負荷誘導的心肌重構(gòu)
　　2.TBHQ可能通過減少心肌細胞凋亡并抑制活性醛產(chǎn)生，從而抑制心力衰竭進展，但與Nrf2抗氧化系統(tǒng)無關
　　3.TBHQ抑制心肌細胞凋亡作用可能由Akt磷酸化介導
　?、?TBHQ抑制心肌細胞凋亡的作用和機制研究
　　目的：
　　1.研究TBHQ在心肌細

8、胞水平對凋亡的調(diào)節(jié)作用
　　2.研究PI3K/Akt信號通路在TBHQ抗心肌細胞凋亡中的作用
　　3.探索TBHQ激活PI3K/Akt信號通路的機制，明確RTK信號通路是否參與其中
　　方法：
　　1.細胞培養(yǎng)
　　2.細胞活力檢測
　　3.蛋白質(zhì)免疫印跡
　　4.Caspase3/7活性測定
　　5.TUNEL法檢測細胞凋亡
　　6.統(tǒng)計學分析
　　結(jié)果：
　　1.我們

9、觀察到，5、10、20、40μM TBHQ對心肌細胞活力無影響
　　2.用不同濃度的TBHQ處理H9c2細胞24小時，發(fā)現(xiàn)TBHQ在10μM到40μM濃度范圍內(nèi)引起明顯的Akt活性增加，而1μM TBHQ對Akt并無影響。用20μM的TBHQ刺激H9c2細胞不同時間，發(fā)現(xiàn)TBHQ自1小時開始就顯著增加Akt磷酸化水平，但隨TBHQ作用時間延長，Akt的磷酸化水平并無增高趨勢。
　　3.4-HNE抑制心肌細胞活性并誘導心肌細胞

10、凋亡
　　我們觀察到，與對照比較，10μM或20μM的4-HNE對細胞活力無顯著影響，自40μM以上的4-HNE呈劑量依賴性顯著降低細胞活力。
　　我們還觀察到，與對照比較，10μM的4-HNE對caspase3/7活性無顯著影響，自20μM以上的4-HNE呈劑量依賴性顯著增強caspase3/7活性。
　　4.TBHQ抑制4-HNE引起的心肌細胞凋亡
　　我們用TUNEL染色的方法觀察到，TBHQ能顯著抑制4-

11、HNE引起的H9c2細胞凋亡。
　　5.TBHQ通過激活PI3K/Akt信號通路抑制4-HNE引起的細胞凋亡
　　我們發(fā)現(xiàn)，TBHQ抑制4-HNE誘導的caspase3裂解，同時伴有Akt磷酸化增強。TBHQ的抗凋亡效應可以被PI3K的抑制劑wortmannin或Akt的抑制劑Akti抑制。為了驗證蛋白質(zhì)免疫印跡的結(jié)果，我們又檢測了caspase3/7活性，并發(fā)現(xiàn)TBHQ可以抑制4-HNE引起的caspase3/7激活，TB

12、HQ的這一效應同樣可以被wortmannin或Akti抑制。
　　6.TBHQ抑制4-HNE引起的原代心肌細胞凋亡
　　Western blot結(jié)果顯示，4-HNE存在與否并不影響TBHQ對原代心肌細胞激活Akt的效應。TBHQ也可以抑制4-HNE誘導的原代心肌細胞caspase3/7激活。而且，在促心肌肥厚因子內(nèi)皮素-1存在的情況下，TBHQ仍然對原代心肌細胞具有抗凋亡作用。
　　7.PTP1B和PTEN抑制劑對TB

13、HQ磷酸化Akt的影響
　　我們發(fā)現(xiàn)，PTP1B抑制劑顯著增加H9c2細胞的Akt磷酸化水平，然而，存在PTP1B制劑的條件下，TBHQ并沒有進一步增加Akt磷酸化水平。
　　我們還發(fā)現(xiàn)，PTEN抑制劑顯著增加H9c2細胞的Akt磷酸化水平，然而，存在PTEN抑制劑的條件下，TBHQ仍可以進一步增加Akt磷酸化水平。
　　8.TBHQ對蛋白酪氨酸磷酸化水平的影響
　　我們發(fā)現(xiàn)，在5μM到40μM濃度范圍內(nèi)，TBH

14、Q顯著增加H9c2細胞的蛋白酪氨酸磷酸化水平。
　　9.TBHQ對IGF-1R磷酸化水平的影響
　　我們發(fā)現(xiàn)，在10μM到40μM濃度范圍內(nèi)，TBHQ顯著增加H9c2細胞的IGF-1R磷酸化水平。
　　結(jié)論：
　　1.TBHQ具有抗心肌細胞凋亡的作用，這種作用是PI3K/Akt通路介導的
　　2.我們的結(jié)果提示TBHQ對PI3K/Akt信號通路的激活作用可能與PTP1B的抑制和IGF-1R信號通路活性增加有

15、關
　　Ⅲ TBHQ干預后對不同細胞和組織中Akt作用的藥理研究
　　目的：
　　1.TBHQ對體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞和3T3成纖維細胞中Akt活性的影響
　　2.TBHQ在整體水平對正常肝臟、腎臟、腦和主動脈組織中Akt活性的影響
　　方法：
　　1.人臍靜脈內(nèi)皮細胞和3T3細胞的培養(yǎng)
　　2.動物分組
　　3.蛋白質(zhì)免疫印跡
　　4.統(tǒng)計學分析
　　結(jié)果：
　　1

16、.用濃度為1、10、50μM的TBHQ分別處理人臍靜脈內(nèi)皮細胞24小時，用TBHQ的溶劑DMSO作為對照處理細胞，用western blot的方法檢測TBHQ對人臍靜脈內(nèi)皮細胞Akt磷酸化的影響。我們發(fā)現(xiàn)，隨TBHQ藥物濃度增加，人臍靜脈內(nèi)皮細胞的磷酸化Akt表達水平逐漸升高。
　　2.用濃度為1、10、50μM的TBHQ分別處理3T3成纖維細胞24小時，用TBHQ的溶劑DMSO作為對照處理細胞，用western blot的方法檢

17、測TBHQ對3T3成纖維細胞Akt磷酸化的影響。我們發(fā)現(xiàn)，隨TBHQ藥物濃度增加，3T3細胞的磷酸化Akt表達水平逐漸升高。
　　3.用western blot的方法檢測TBHQ對肝臟組織Akt磷酸化的影響。我們發(fā)現(xiàn)，TBHQ使肝臟組織中的磷酸化Akt水平顯著增加。
　　4.用western blot的方法檢測TBHQ對腎臟組織Akt磷酸化的影響。我們發(fā)現(xiàn)，TBHQ使腎臟組織中的磷酸化Akt水平顯著增加。
　　5.用w

18、estern blot的方法檢測TBHQ對主動脈組織Akt磷酸化的影響。我們發(fā)現(xiàn)，TBHQ使主動脈組織中的磷酸化Akt水平顯著增加。
　　6.用western blot的方法檢測TBHQ對腦組織Akt磷酸化的影響。我們發(fā)現(xiàn)，TBHQ并未影響腦組織中的Akt磷酸化水平。
　　結(jié)論：
　　1.TBHQ可以激活人臍靜脈內(nèi)皮細胞和3T3成纖維細胞中的Akt
　　2.TBHQ整體干預可以激活小鼠肝臟、腎臟、主動脈組織中的A