缺血后適應(yīng)對壓力超負荷誘導(dǎo)小鼠肥厚心肌缺血再灌注損傷的保護作用及機制研究.pdf

1、目的：本研究旨在觀察缺血后適應(yīng)（Ipost)對壓力負荷誘導(dǎo)的肥厚心肌缺血再灌注（I/R）損傷的影響，并進一步探討再灌注損傷搶救激酶（RISK）在Ipost減輕肥厚心肌缺血再灌注損傷中的作用機制。本研究包括：1）通過顯微外科技術(shù)建立小鼠主動脈弓縮窄壓力超負荷模型，探討心臟形態(tài)及功能變化的規(guī)律，確定心肌肥厚發(fā)生的時間點；2）建立小鼠離體肥厚心臟Langendorff缺血再灌注模型，研究缺血后適應(yīng)對離體小鼠肥厚心肌缺血再灌注損傷中的保護作用，

2、探討再灌注損傷搶救激酶在該保護作用中的分子機制；3）探討再灌注損傷搶救激酶中細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK1/2）作為Bcl-2與Bax的上游靶酶在Ipost減少心肌缺血再灌注細胞凋亡中的作用。
　　 方法：課題第一部分：12周齡C57/BL小鼠通過主動脈弓縮窄（TAC）建立心肌肥厚模型，在1、4、8、12、16周時進行高頻心臟超聲、血流動力學(xué)、組織重量及心肌病理學(xué)檢測，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）半定量測定心房利鈉肽（ANP

3、）、腦鈉素（BNP）、α-肌球蛋白重鏈（α-MHC）、β-肌球蛋白重鏈（β-MHC）、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-β1）、心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+-ATP酶（SERCA2a）mRNA的表達。
　　 課題第二部分：12周齡C57/BL小鼠通過主動脈弓縮窄4周建立心肌肥厚模型，利用Langendorff灌流裝置建立小鼠肥厚心肌I/R模型，穩(wěn)定灌流30min，分為4組，1）I/R組：I/R組為停止灌流30min后直接恢復(fù)再灌注120min，在停止

4、灌流前后不做任何特殊處理；2）Ipost組（采取缺血10s及再灌注10s的3次Ipost周期）：停止灌流30min，在完全再灌注早期給予反復(fù)短暫灌流/停止灌流的后適應(yīng)，之后持續(xù)120min的灌注；3）I/R+抑制劑組[分別用ERK1/2特異性抑制劑PD98059及蛋白激酶-B（Akt）特異性抑制劑wortmannin]：在恢復(fù)再灌注的開始不進行后適應(yīng)循環(huán)，給予含抑制劑KH液持續(xù)灌流15min后，再恢復(fù)無PD98059的KH液灌流；4）I

5、post+抑制劑組：在再灌注120min起始，給予3次后適應(yīng)循環(huán)的同時給予抑制劑的KH液持續(xù)灌流15min后，再恢復(fù)無抑制劑的KH液灌流。在再灌注120min時測定梗死心肌面積，采用微型測壓球囊同步記錄心功能的變化，分別在再灌注15min及2h時用Western 印跡法測定左室心肌ERK1/2、核蛋白s6激酶（P70S6K）、蛋白激酶B（Akt）、糖原合成酶-3β（GSK-3β）蛋白表達。
　　 課題第三部分：12周齡C57/B

6、L小鼠通過主動脈弓縮窄4周建立心肌肥厚模型，利用Langendorff灌流裝置建立小鼠肥厚心肌I/R模型，30min全心缺血隨后再灌注120min。分為4組，I/R組、Ipost組（采取缺血10s及再灌注10s的3次Ipost周期）、I/R+PD98059組、Ipost+PD98059組，進行心臟血流動力學(xué)、心肌梗死范圍檢測，Western 印跡方法檢測ERK1/2、Bcl-2、Bax、細胞色素C（Cyt.C）蛋白表達水平，脫氧核苷酸轉(zhuǎn)

7、移酶介導(dǎo)的生物素原位缺口末端標(biāo)記（TUNEL)法檢測心肌細胞的凋亡。
　　 結(jié)果：
　　 課題第一部分：1)與假手術(shù)組比較，縮窄組左室收縮期及舒張期前壁和后壁厚度、左心室收縮末期及舒張末期內(nèi)徑于術(shù)后呈逐漸增加趨勢；左心室射血分?jǐn)?shù)于術(shù)后12周顯著降低（P＜0.05）。左室收縮壓及左室壓力上升和下降最大速率于術(shù)后4周明顯增加，8～12周保持穩(wěn)定，16周明顯下降；左室舒張末壓于術(shù)后8周持續(xù)增加（P均＜0.05）。顯示心肌由左室

8、肥厚最終發(fā)展為心力衰竭。2）組織形態(tài)學(xué)天狼猩紅測量心肌膠原含量及凋亡指數(shù)顯示從4周到16周呈增加趨勢；3）與假手術(shù)組比較，縮窄組心肌組織ANP、BNP、β-MHC、TGF-β1 mRNA術(shù)后1周至16周表達呈持續(xù)性增加；而α-MHC、SERCA2a mRNA表達呈持續(xù)性降低。
　　 課題第二、三部分：1）成功建立并改良了小鼠離體肥厚心臟Langendorff缺血后適應(yīng)模型；2）與I/R組比較，Ipost組的心肌梗死面積[（23.

9、6±2.8）%]較I/R組[（40.2±4.6）%]明顯降低（P＜0.05)；小鼠心臟血流動力學(xué)指標(biāo)左心室收縮壓、左心室壓力變化最大速率顯著改善（P＜0.05)；電鏡觀察發(fā)現(xiàn)Ipost可減輕缺血再灌注引起的線粒體損傷；凋亡指數(shù)顯著降低[（16±2）/100 vs（37±5）/100，P＜0.05]；3）與I/R組相比，Ipost組心肌的再灌注15min及2h ERK1/2、P70S6K磷酸化蛋白水平顯著增高，而Akt、GSK-3β磷酸化

10、蛋白水平無明顯變化（P均＞0.05）。4）Ipost組心肌的Bcl-2、線粒體Cyt.C表達顯著增加，Bax、胞漿Cyt.C蛋白表達顯著降低（P＜0.05)。與I/R組比較，I/R+PD98059組、Ipost+PD98059組上述指標(biāo)無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05)。顯示在再灌注的最初15min使用PD98059能消除Ipost對肥厚心肌的上述保護作用并顯著增加心肌梗死面積，與I/R組水平相同。
　　 結(jié)論：
　　 1）

11、通過主動脈弓縮窄，可以建立穩(wěn)定的小鼠壓力超負荷誘導(dǎo)左室心肌早期代償性向心性肥厚致晚期心力衰竭的動物模型；2）利用小鼠離體肥厚心臟Langendorff缺血再灌注模型，Ipost能有效地減輕離體小鼠肥厚心肌缺血再灌注損傷，能明顯減少心肌I/R損傷導(dǎo)致的線粒體損傷，減少心肌梗死面積，其中再灌注損傷搶救激酶中ERK1/2信號通路在再灌注早期即參與了Ipost對缺血再灌注肥厚心肌保護作用，磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B(PI3K-Akt)信號通路