乙醛脫氫酶2缺失加重壓力超負荷誘導(dǎo)的心功能不全及心肌能量重構(gòu)的機制研究.pdf

1、近年來，臨床及實驗室研究均證明能量代謝能夠影響心肌重構(gòu)及心衰的病理生理過程1,2，最顯著的變化是心肌脂肪酸利用率的下降伴隨葡萄糖氧化利用的上升，最終將導(dǎo)致能量供需不平衡以及線粒體功能失調(diào)3。心衰心肌長期維持這種低效率的能量代謝模式會導(dǎo)致ATP生成受損，并且阻礙化學(xué)能量向機械能量的轉(zhuǎn)化，最終結(jié)果是不可逆的心力衰竭4,5。最近實驗研究證實腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)激活劑AICAR和metformin能夠逆轉(zhuǎn)心臟重構(gòu)，其機制是通過保持AM

2、PK的活性從而保證心肌ATP供應(yīng)水平6。這些證據(jù)提示我們改善心肌能量供應(yīng)模式的策略可能是未來治療心衰的有效方向。然而，在心衰晚期，調(diào)控或改善已經(jīng)發(fā)生偏移的代謝模式是非常困難的，因此尋找一個能在疾病早期預(yù)測代謝模式變化，甚至早期調(diào)控或維持能量代謝模式的分子就更為重要也更可行。
　　線粒體乙醛脫氫酶2(ALDH2)，作為線粒體內(nèi)的關(guān)鍵酶，已經(jīng)在多種心肌損傷過程中被證實是心肌內(nèi)源性保護因子，包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、缺血再灌、心肌梗死及糖尿病心肌

3、病等7-11。ALDH2的經(jīng)典功能是處理能量底物氧化過程中的副產(chǎn)物-毒性醛類，例如4-羥壬烯醛等。最近，Jin等報道ALDH2缺失可促進心肌葡萄糖利用同時導(dǎo)致代謝重構(gòu)12，同時Ren等也報道AMPK的磷酸化水平受ALDH2調(diào)控8。因此ALDH2的作用已經(jīng)逐步擴展至能量代謝領(lǐng)域。至今，ALDH2對成年心臟主要能量底物，即脂肪酸及葡萄糖代謝的影響還沒有被完全揭示。我們基于前期研究的證據(jù)推測ALDH2可能通過AMPK及其他能量通路發(fā)揮調(diào)控能量

4、代謝模式的作用，而非僅限于處理代謝垃圾。在東亞人群中ALDH2缺失型分布較普遍，而這種缺失在西方人群中很少見13。如果其能夠影響能量代謝進而參與心衰的病理生理過程，我們的研究可能提供基于不同ALDH2基因型的更適應(yīng)東亞特別是中國人群特征的預(yù)警或保護手段。
　　在本研究中我們通過對ALDH2敲除小鼠進行壓力超負荷刺激，誘導(dǎo)心衰后進行功能學(xué)、形態(tài)學(xué)、能量模式及能量信號通路四個層面的研究，證實了ALDH2通過調(diào)控心肌脂肪酸和葡萄糖代謝平

5、衡，參與心衰的發(fā)生和發(fā)展過程，其分子機制可能是通過對AMPK/PPARa——mCPT-I通路而實現(xiàn)的。并從以下幾部分進行論述:
　　第一部分 乙醛脫氫酶2對壓力超負荷小鼠心功能影響的研究
　　目的:利用主動脈弓縮窄方法構(gòu)建壓力超負荷小鼠模型，并觀察壓力超負荷對ALDH2敲除(ALDH2-/-)及野生型(WT)小鼠心臟功能影響的差異。
　　方法:取8-10周齡WT及ALDH2-/-雄性健康成年鼠，利用主動脈弓縮窄(TAC

6、)構(gòu)建壓力超負荷模型，并依照TAC不同時長隨機分為4組:TAC-對照組(Sham)，TAC-2周，TAC-4周及TAC-8周。經(jīng)胸行心臟超聲檢查，觀察EF和FS值。選取兩基因型心功能差異最大的時間點作為后續(xù)實驗的基礎(chǔ)。時間點(TAC-4周)選取后，超聲檢查EF、FS、左室壁厚度及內(nèi)徑;經(jīng)頸動脈測壓檢查左室內(nèi)壓及主動脈壓。
　　結(jié)果:本部分研究發(fā)現(xiàn)，ALDH2-/-及WT小鼠基礎(chǔ)狀態(tài)無顯著差異;TAC后ALDH2-/-心功能下降更快

7、，心室重構(gòu)更顯著，特別是在術(shù)后4周兩基因型小鼠心功能差異最大，因此選擇此時間點為后續(xù)實驗基礎(chǔ);TAC4周后ALDH2-/-小鼠EF、FS均下降，IVS;d、LVPW;d均增厚，LVESD擴大，證實心功能惡化較野生小鼠更重;血流動力學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)ALDH2-/-在TAC后LVESP升高而LVEDP無明顯差異，主動脈血壓在基因型之間無顯著差異。
　　結(jié)論:本部分研究成功利用主動脈弓縮窄方法在ALDH2-/-小鼠體內(nèi)構(gòu)建壓力超負荷模型。成功

8、選擇心功能差異最大的術(shù)后4周作為后續(xù)實驗提供時間基礎(chǔ)。證實ALDH2-/-可促進壓力超負荷引起心功能失代償。
　　第二部分 乙醛脫氫酶2對壓力超負荷小鼠心肌細胞形態(tài)影響的研究
　　目的:利用主動脈弓縮窄方法構(gòu)建壓力超負荷小鼠模型，觀察壓力超負荷對ALDH2-/-及WT小鼠心肌重構(gòu)、心肌細胞及亞細胞器形態(tài)的影響。
　　方法:取8-10周齡WT及ALDH2-/-雄性健康成年鼠，利用TAC構(gòu)建壓力超負荷模型。TAC-4周后取

9、材，稱量體重、心臟重量及濕肺重量，拍照后固定行HE、MASSON染色，觀察心肌重構(gòu)、心肌細胞肥大及纖維化情況。利用TUNEL染色檢測心肌細胞凋亡，利用電鏡觀察心肌細胞器，包括線粒體和肌纖維形態(tài)。
　　結(jié)果:本部分研究發(fā)現(xiàn)，TAC術(shù)后4周，ALDH2-/-小鼠心臟明顯增大、增重，伴隨肺水腫的出現(xiàn);左室中段橫截面積增大，提示心室壁增厚，心腔擴張;HE染色示心肌細胞肥大伴隨致密度下降和空泡化出現(xiàn);MASSON染色示纖維化較WT小鼠輕;T

10、UNEL示心肌細胞凋亡加重;電鏡示線粒體結(jié)構(gòu)受損嚴重伴隨心肌纖維斷裂。
　　結(jié)論:本部分研究通過心臟大體、組織、細胞及亞細胞器水平的形態(tài)學(xué)觀察，證實ALDH2-/-可促進壓力超負荷可引起心肌重構(gòu)、心肌細胞肥大、凋亡和亞細胞器的損傷，從而加重功能的失代償。
　　第三部分 乙醛脫氫酶2對壓力超負荷小鼠心肌能量代謝模式影響的研究
　　目的:利用主動脈弓縮窄方法構(gòu)建壓力超負荷小鼠模型，觀察壓力超負荷對ALDH2-/-及WT小鼠

11、脂肪酸、葡萄糖代謝率和ATP含量的影響。
　　方法:取8-10周齡WT及ALDH2-/-雄性健康成年鼠，利用TAC構(gòu)建壓力超負荷模型，TAC-4周后取材。同時利用ALDH2干擾的原代心肌細胞構(gòu)建細胞牽張模型，牽張12h后收集。利用液相色譜聯(lián)合質(zhì)譜技術(shù)檢測不同長度脂酰輔酶A和脂酰肉堿絕對含量及二者比值，以反應(yīng)脂肪酸代謝水平。利用PET-CT掃描18F-FDG和γ計數(shù)，探測心肌葡萄糖攝取率。利用熒光素酶技術(shù)檢測心肌及原代心肌細胞內(nèi)AT

12、P含量。
　　結(jié)果:本部分研究發(fā)現(xiàn)，ALDH2-/-小鼠基礎(chǔ)狀態(tài)心肌組織內(nèi)脂酰輔酶A儲積但脂酰肉堿含量明顯較少，TAC術(shù)后4周脂酰輔酶A和脂酰肉堿含量同時下降，提示ALDH2-/-抑制脂肪酸向線粒體內(nèi)轉(zhuǎn)運，壓力超負荷則整體抑制脂肪酸的利用水平;ALDH2-/-小鼠基礎(chǔ)狀態(tài)心肌葡萄糖攝取率與WT無明顯差異，且在壓力超負荷刺激后ALDH2-/-組明顯升高;ATP在非手術(shù)ALDH2-/-小鼠心肌中顯著下降，壓力超負荷后進一步下降。細胞水

13、平結(jié)果與心肌組織結(jié)果相同。
　　結(jié)論:本部分研究通過脂酰輔酶A、脂酰肉堿及18F-FDG等能量底物攝取利用率水平的觀察，證實ALDH2-/-可促進壓力超負荷可引起脂肪酸利用率下降及葡萄糖利用率上升，即能量代謝模式的重構(gòu)，同時導(dǎo)致ATP含量的減少，從而促進心肌功能的惡化。
　　第四部分 乙醛脫氫酶2對壓力超負荷小鼠心肌能量代謝影響的分子機制研究
　　目的:利用主動脈弓縮窄方法構(gòu)建壓力超負荷小鼠模型，觀察壓力超負荷對ALD

14、H2-/-及WT小鼠能量代謝通路關(guān)鍵分子表達的影響。
　　方法:取8-10周齡WT及ALDH2-/-雄性健康成年鼠，利用TAC構(gòu)建壓力超負荷模型，TAC-4周后取材。同時利用ALDH2干擾的原代心肌細胞構(gòu)建細胞牽張模型，牽張12h后收集。利用western-blot檢測心肌及原代細胞內(nèi)能量代謝總控分子AMPK，p-AMPK及PPARa的蛋白表達水平;同時利用real-time PCR檢測下游脂肪酸代謝mCPT-I及葡萄糖代謝PDH

15、的mRNA水平。
　　結(jié)果:本部分研究發(fā)現(xiàn)，ALDH2-/-小鼠基礎(chǔ)狀態(tài)心肌組織內(nèi)p-AMPK及PPARa蛋白水平表達明顯減少，TAC術(shù)后改變不明顯，提示ALDH2敲除能夠獨立抑制能量代謝上游關(guān)鍵分子;ALDH2-/-小鼠基礎(chǔ)狀態(tài)mCPT-I RNA表達下降，且在壓力超負荷刺激后進一步下降;PDH RNA水平在四組小鼠心肌中表達無明顯差異。細胞水平結(jié)果與心肌組織結(jié)果相似，但PPARa在牽張后有下降趨勢。
　　結(jié)論:本部分研究