17β-雌二醇對ox-LDL誘導人外周血內皮祖細胞凋亡的影響.pdf

1、目的：觀察17β-雌二醇（E2）對由氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）誘導人血管內皮祖細胞（EPCs）凋亡的影響及其影響機制，旨在探討雌激素抑制動脈粥樣硬化和減少女性冠心病的可能機制。過去有關雌激素對EPCs影響的研究多著重于促進EPCs增殖遷移和血管生成方面，而對EPCs凋亡方面則重視不夠。本實驗使用ox-LDL作為誘導劑來觀察E2對內皮細胞的前體EPCs凋亡的影響。由于ox-LDL在動脈粥樣硬化（AS）中的重要地位，因此雌激素抑制由

2、ox-LDL誘導的凋亡更能說明其抗AS作用。本研究還就E2對抑制凋亡的機制和途徑進行觀察，即觀察E2是否通過其受體起作用，是否與PI3K/Akt途徑有關。 方法：①外周單個核細胞的分離：肝素抗凝抽取人外周血50ml（肝素1000U）。PBS對倍稀釋，按1：1加在人淋巴細胞分離液上，2000R/min離心，吸取中間白膜層單個核細胞，1500R/M離心洗滌三次，取細胞懸液與等體積2g/L臺盼藍混合，進行細胞活力計算（死細胞-藍色、活

3、細胞不著色），活細胞數(shù)占98%以上可進行接種。以上在抽取血樣后四小時內完成。②誘導分化：纖連蛋白用PBS溶解稀釋為1 ng/ml后包被24孔板，每孔中加入100ul，置于37℃溫箱中孵育2h，臨用前吸出多余的液體，用PBS洗滌兩次。分用M199培養(yǎng)液調整細胞密度，接種于培養(yǎng)瓶中，成纖維細胞多于24小時內貼壁，因此培養(yǎng)24小時后取未貼壁細胞以4×106/c㎡密度接種于包被有纖維連接蛋白（FN）的24孔培養(yǎng)板（每孔M199培養(yǎng)液1 ml），

4、添加10%胎牛血清、1%青鏈霉素（1萬單位/ml）、VEGF50 ng/ml、 b-FGF1 ng/ml，置于5%CO2、飽和濕度、37℃孵育箱中培養(yǎng)四天，用磷酸鹽緩沖液洗掉非貼壁細胞，換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)至7d，進一步用PBS洗掉非貼壁細胞，貼壁細胞供實驗用。③EPCs鑒定：利用免疫組化法檢測細胞表抗CD34及VEGFR-2；利用免疫熒光法檢測細胞表抗CD133；用EPCs特異性抗體Dil-ac-LDL和FITC-UEA-1對貼壁細胞進行

5、免疫熒光染色。④EPCs調亡的觀察：采用異硫氰酸熒光素標記的Annexin-v、碘化丙錠（PI）雙染色免疫熒光法檢測EPCS的凋亡。貼壁細胞直接用蓋玻片來培養(yǎng)7d后，用PBS洗滌兩次，在500ul的Binding Buffer中加入2ul異硫氰酸熒光素標記的Annexin-v、5ul PI混勻。將上述溶液加于蓋玻片表面，使長有細胞的蓋玻片表面均勻覆蓋，避光，室溫反應10分鐘。將蓋玻片倒置于載玻片上，于熒光顯微鏡下雙色濾光片觀察。⑤E2對

6、EPCs凋亡的觀察：用不同濃度E2干預經(jīng)ox-LDL誘導凋亡的EPCs，觀察其劑量依賴性及時間依賴性。⑥機制研究加入雌激素受體阻斷劑ICI182，780及PI3K抑制劑LY294002后觀察凋亡的影響。 結果：⑴E2對EPCs的自然凋亡有抑制作用，100 nmol/L濃度E2作用下的凋亡率為（8．23±0．6）%，與空白對照組（12．31±0．34）%的凋亡率相比有明顯的統(tǒng)計學意義（P<0．01）。⑵E2抑制ox-LDL誘導的E

7、PCs凋亡具有劑量依賴性。在E2濃度10nmol/L-100 nmol/L范圍內隨著其濃度的增加，在干預24h后檢測，其抗凋亡的作用逐漸增強。在10 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L濃度E2下凋亡率依次為（22．39±0．68）%、（20．42±2．56）%、（13．93±0．3）%，與ox-LDL誘導組（31．43±1．05）%的凋亡率比較，有顯著的統(tǒng)計學意義（P<0．01）。在干預48h后檢測凋亡率依次為（23

8、．28±0．64）%、（19．25±1．16）%、（14．57±0．45）%，與24h結果的比較無明顯統(tǒng)計學意義（P>0．05）。⑶雌激素受體阻斷劑ICI182，780與PI3K抑制劑LY294002能夠明顯抑制E2的抗凋亡作用，加入雌激素受體阻斷劑ICI182，780組的凋亡率上升至（28．6±1）%，加入PI3K抑制劑LY294002組的凋亡率上升至（25．2±1）%，與E2組（13．9±0．3）%的凋亡率相比有明顯統(tǒng)計學意義（P<