TCF1介導(dǎo)的Wnt-β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)小鼠胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化.pdf

1、目的：Wnt/β-catenin信號(hào)通路是一種經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路，參與廣泛的生物學(xué)過(guò)程，諸如細(xì)胞分化、增殖、生存、凋亡、黏附、肥大、老化。有研究表明，在分化早期階段激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路可促進(jìn)小鼠胚胎干細(xì)胞向中胚層及心肌細(xì)胞分化，然而，Wnt/β-catenin信號(hào)通路促心肌細(xì)胞分化作用的具體機(jī)制仍不清楚?；罨腤nt/β-catenin信號(hào)通路中β-catenin蛋白的降解減少，大量β-catenin在細(xì)胞內(nèi)聚集，穩(wěn)

2、定的β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核，與Tcf/Lef1轉(zhuǎn)錄子結(jié)合并激活下游靶基因的表達(dá)進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞生理特性，其中Tcf/Lef1家族中包括Tcf1、Tcf3、Tcf4和Lef1。因此，本研究主要探討Wnt/β-catenin信號(hào)通路中Tcf/Lef1轉(zhuǎn)錄子在小鼠胚胎干細(xì)胞（mESCs）向心肌細(xì)胞分化中的作用。
　　方法：首先采用懸浮一步培養(yǎng)法形成擬胚體（EBs）,在EBs形成后第2天至第5天加入CHIR99021，命名為CHIR99

3、021組；在EBs形成后第2天至第5天加入Wnt3a，命名為Wnt3a組，將自動(dòng)分化的EBs命名為對(duì)照組。采用qRT-PCR法檢測(cè)中胚層標(biāo)志基因Brachyury、心肌前體細(xì)胞標(biāo)志基因Nkx2.5、心肌細(xì)胞特異性標(biāo)志基因α-MHC、cTnT和Cx43 mRNA的表達(dá)。運(yùn)用免疫熒光染色法檢測(cè)心肌細(xì)胞特異性蛋白--肌球蛋白重鏈（α-MHC）、肌鈣蛋白T（cTNT）及膜聯(lián)蛋白43（CX43）的定位表達(dá)。采用 Western blot法檢測(cè)α-

4、MHC蛋白相對(duì)表達(dá)量。從而對(duì)比分析CHIR99021與Wnt3a在心肌細(xì)胞分化中的作用。然后使用PiggyBac vector（PB載體）構(gòu)建PB-Tcf/Lef1載體以過(guò)表達(dá)Tcf/Lef1基因，將puromycin加入培養(yǎng)液中以篩選過(guò)表達(dá)細(xì)胞系；采用pLKO.1慢病毒載體構(gòu)建Tcf/Lef1-shRNA載體，使用293T細(xì)胞進(jìn)行病毒包被，將獲取的病毒感染小鼠胚胎干細(xì)胞，再用puromycin篩選低表達(dá)細(xì)胞系。將獲得的過(guò)表達(dá)/低表達(dá)細(xì)

5、胞系通過(guò)懸浮一步培養(yǎng)法形成EBs，在EBs形成后的第7天將其貼壁培養(yǎng)，通過(guò)倒置顯微鏡觀察其生長(zhǎng)狀態(tài)，采用 qRT-PCR法檢測(cè)Brachyury、Nkx2.5、α-MHC、cTnT和Cx43 mRNA的表達(dá)。運(yùn)用免疫熒光染色法檢測(cè)心肌細(xì)胞特異性蛋白--肌球蛋白重鏈（α-MHC）的定位表達(dá)。采用Western blot法檢測(cè)α-MHC蛋白相對(duì)表達(dá)量。從而對(duì)比分析Tcf/Lef1轉(zhuǎn)錄子在小鼠胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化中作用。
　　結(jié)果：

6、通過(guò)免疫熒光染色法我們發(fā)現(xiàn)胚胎干細(xì)胞源擬胚體中有心肌細(xì)胞特異性蛋白的定位表達(dá)，在CHIR99021和Wnt3a誘導(dǎo)分化過(guò)程中，通過(guò)qRT-PCR法我們發(fā)現(xiàn)Brachyury在分化第7天達(dá)高峰，而后逐漸下降；Nkx2.5、α-MHC、cTnT和Cx43的基因表達(dá)量逐漸增加，第15天增加最顯著，且CHIR99021組和Wnt3a組高于對(duì)照組；CHIR99021組優(yōu)于Wnt3a組（*P<0.05，**P<0.01）。通過(guò)Western blo

7、t法我們發(fā)現(xiàn) CHIR99021組和 Wnt3a組α-MHC蛋白表達(dá)量明顯高于對(duì)照組，CHIR99021組高于Wnt3a組。我們使用PB載體過(guò)表達(dá)Tcf/Lef1基因，采用pLKO.1慢病毒載體低表達(dá)Tcf/Lef1基因，通過(guò)qRT-PCR和Western blot發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性細(xì)胞構(gòu)建成功。隨后我們發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)Tcf/Lef1細(xì)胞系在分化過(guò)程中Brachyury表達(dá)量在第7天達(dá)高峰，而后逐漸下降；Nkx2.5、α-MHC、cTnT和Cx43的

8、基因表達(dá)量逐漸增加，第15天增加最為明顯，且均高于對(duì)照組，其中 Tcf1最為顯著（*P<0.05，**P<0.01）。通過(guò)Western blot法我們發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)Tcf/Lef1細(xì)胞系在分化過(guò)程中心肌細(xì)胞標(biāo)志蛋白α-MHC相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照組，且 Tcf1最為明顯。相反，低表達(dá)Tcf/Lef1抑制了心肌細(xì)胞的分化，尤其是Tcf1的抑制作用較為明顯。
　　結(jié)論：Wnt/β-catenin信號(hào)通路中Tcf1轉(zhuǎn)錄子可促進(jìn)小鼠胚胎干細(xì)胞