骨髓間充質(zhì)干細胞分化為心肌細胞與Wnt-β-catenin通路中β-catenin的關(guān)系.pdf

1、目的
　　擴張型心肌病(dilatedcardiomyoPathy，DCM)為死亡率較高的一種疾病，目前尚未報道其有效的治療措施。近些年研究的干細胞治療技術(shù)為它帶來了新的曙光。本研究試圖通過5-aza誘導骨髓間充質(zhì)干細胞分化為心肌細胞，并了解在該過程中Wnt/β-catenin信號通路是否參與分化過程的調(diào)控，旨在為臨床充分利用來源豐富的BMSCs(bonemarrowmesenchymalcells，BMSCs)移植治療終末期擴張

2、型心肌病提供有效的實驗依據(jù)。
　　方法:
　　從200g左右的SD雄性大鼠股骨提取BMSCs，利用貼壁培養(yǎng)方法，培養(yǎng)至P3代細胞后利用流式細胞儀（flowcytometry，F(xiàn)CM）來檢測細胞的表面抗原:主要選取CD29、CD34、CD45、CD105等四種表面抗原進行檢測，從而達到鑒定骨髓間充質(zhì)干細胞的目的。臺盼藍染色計數(shù)細胞活性。選擇活性較好，純度較高的細胞制成細胞懸液，隨機均勻分成a組、b組、c組、d組，分別用0μmo

3、l/L，5μmol/L，10μmol/L，20μmol/L的5-aza進行干預，2周后比較總體細胞水平的活性率及心肌細胞的百分比，從而確定誘導分化的最佳濃度。此后將P3代骨髓間充質(zhì)干細胞隨機分成2組，即實驗組及對照組。實驗組為A組需加入最佳誘導濃度的5-aza培養(yǎng)24h誘導分化，經(jīng)處理后更換為不含5-aza的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4周，根據(jù)培養(yǎng)時間的不同分成四組，即為培養(yǎng)第1周末、第2周末、第3周末、第4周末的各組細胞，分別對應為A1、A2、A

4、3、A4四組。對照組B組不添加5-aza，參照A組的分組方法分別分為B1、B2、B3、B4四組;對各組細胞進行如下操作:①記錄不同時期細胞的生長狀態(tài)及形態(tài);②行免疫熒光檢測心肌細胞中的特異性cTnT來鑒定心肌細胞，計數(shù)心肌細胞百分比;③采用蛋白印跡法(westernblot,WB)檢測各組cTnT及β-catenin蛋白表達量，比較各組蛋白表達的變化。
　　結(jié)果:
　　應用FCM檢測顯示貼壁法培養(yǎng)獲取的P3代BMSCs高表達

5、CD29、CD105（分別為93.37％、89.08％）;而極少的表達CD34、CD45(分別為0.89％、1.06％)。經(jīng)臺盼蘭試驗測定其整體活細胞百分率＞95％;
　　通過對P3代BMSCs分別加入濃度為0μmol/L，5μmol/L，10μmol/L，20μmol/L的5-aza進行干預的a組、b組、c組、d組，2周后細胞的活性率及心肌細胞的百分率分別如下:①總細胞活性率:a組為94.2±7.4(％)，b組為93.6±7.1

6、(％)，c組93.5±6.7(％)，d組80.1±9.2(％)，將各組數(shù)據(jù)行方差分析得出，a組、b組、c組各組細胞間總細胞活性率無明顯差異，但與d組比較，P＜0.05，有統(tǒng)計學意義。②心肌細胞百分比:a組、b組兩組未見心肌細胞，心肌細胞百分比為0，c組心肌細胞百分率為3.33±0.58(％)，4.33±0.58(％)，將c組、d組行配對t檢驗得出，P＞0.05，無統(tǒng)計學意義。綜合分析得出:c組即經(jīng)10μmol/L的5-aza處理可將BM

7、SCs誘導分化為心肌細胞，總細胞活性率較高。
　　由BMSC分化而來的心肌細胞經(jīng)標記特異性eTnT蛋白的免疫熒光染色后，在顯微鏡下表現(xiàn)為染紅色熒光的細胞，各組心肌細胞百分比分別為:A1組及B組所有組別細胞顯鏡下未見心肌細胞形成，百分比為0(％);A2心肌細胞百分率為3.33±1.53(％);A3組心肌細胞百分比為19.67±1.53(％)，A4組為25.67±2.1(％)。將所得數(shù)據(jù)行方差分析得出A2、A3、A4各組間P＜0.05

8、，有統(tǒng)計學差異。westernblot技術(shù)檢測cTnT的表達結(jié)果，A2組（1.231±0.017）、A3組為（6.606±0.227）、A4為（8.511±0.392）明顯高于B1（0.824±0.012）、B2(0.826±0.138)、B3(0.827±0.02)、B4(0.827±0.004)，A1（0.819±0.062），A組、B組行配對t檢驗后得出，A2與B2、A3與B3、A4與B4，P＜0.05，有統(tǒng)計學意義，A1與B1，

9、P＞0.05，無明顯差異。A1、A2、A3、A4各組行方差分析，P＜0.05，各組間存在差異;B組行方差分析則未見差異。免疫熒光與westernblot檢測cTnT結(jié)果是相一致的。
　　各組細胞β-catenin蛋白的表達結(jié)果為:B組各組細胞β-catenin蛋白的表達檢測不出。A組各組表達如下:A1(1.877±0.044)、A2(7.634±0.329)、A3（1.084±0.092）、A4(0.473±0.025)，經(jīng)方差分

10、析得出各組之間差異有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)論:
　　1.全骨髓貼壁法培養(yǎng)可獲得足量、可靠的BMSCs，其表達的表面抗原符合BMSCs的特征。
　　2.5-aza可成功誘導BMSCs分化為心肌細胞，且10μmol/l的5-aza濃度為本實驗的最佳濃度。
　　3.BMSCs分化形成的心肌細胞表達的cTnT蛋白隨時間延長而逐漸增加，分化形成的心肌細胞數(shù)量也隨之增多。
　　4.β-catenin與cTnT表達的存在時