淫羊藿苷及其同系物誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞體外定向分化心肌細(xì)胞構(gòu)效關(guān)系及相關(guān)信號(hào)調(diào)控研究.pdf

1、本課題前期研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿苷(ICA)及其同系物淫羊藿素(ICT)和去甲淫羊藿素(DICT)均能有效促進(jìn)小鼠ES細(xì)胞體外定向分化為心肌細(xì)胞，作用強(qiáng)度依次為ICA＞ICT＞DICT[12]，并且細(xì)胞內(nèi)活性氧(ReactiveOxygenSpecies，ROS)在ICA誘導(dǎo)分化過(guò)程中扮演了重要角色[13]。相反，對(duì)三者體外抗氧化活性研究顯示，DICT體外抗氧化活性最強(qiáng)，ICT次之，ICA在體外幾乎不表現(xiàn)抗氧化活性[14]。ICA，ICT和D

2、ICT均為異戊烯基黃酮類化合物，研究顯示，當(dāng)基本結(jié)構(gòu)相同時(shí)，黃酮類化合物的抗氧化活性往往與結(jié)構(gòu)有關(guān)[15]。ICA，ICT和DICT。結(jié)構(gòu)差異導(dǎo)致的體外抗氧化活性差異是否是其促分化效果不同的原因，尚未被證實(shí)。 因此，本研究擬通過(guò)考察ICA，ICT和DICT對(duì)ROS信號(hào)通路的調(diào)控作用，初步對(duì)其促分化作用構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行研究，以期揭示此類異戊烯基黃酮化合物促分化作用物質(zhì)基礎(chǔ)，為新的促心肌定向分化先導(dǎo)化合物發(fā)現(xiàn)提供依據(jù)。進(jìn)一步我們對(duì)其相關(guān)

3、信號(hào)調(diào)控進(jìn)行了研究，為揭示ICA，ICT和DICT促心肌定向分化深層次機(jī)制，闡明其誘導(dǎo)分化藥理作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為發(fā)展其新應(yīng)用提供理論支持。 1ICA及其同系物誘導(dǎo)ES細(xì)胞定向分化心肌細(xì)胞構(gòu)效關(guān)系研究為探索ICA、ICT和DICT誘導(dǎo)ES細(xì)胞體外定向分化心肌細(xì)胞構(gòu)效關(guān)系，本研究考察了ICA和ICT啟動(dòng)心肌定向分化過(guò)程中對(duì)ROS信號(hào)通路調(diào)控作用，采用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)了ICA和ICT對(duì)擬胚體(embryoidbodies，EBs

4、)內(nèi)ROS水平影響。共孵育抗氧化劑vitaminE或pyrrolidinedithiocarbamate(PDTC)，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide-adeninedinucleotidephosphate，NADPH)氧化酶抑制劑apocynin，評(píng)價(jià)ROS在ICA促心肌定向分化中作用及其與NADPH氧化酶關(guān)系。Westernblot和免疫熒光法檢測(cè)ICA和ICT作用后胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellul

5、arsignal-regulatedKinase，ERK)、c-Jun氮末端蛋白激酶(c-junN-terminalKinase，JNK)和絲裂素活化蛋白激酶p38(mitogen-activatedproteinKinasep38，p38MAPK)磷酸化水平變化，并觀察選擇性抑制p38MAPK及ERK后對(duì)ICA誘導(dǎo)心肌細(xì)胞定向分化的影響。同時(shí)考察ICA和ICT介入后，NOX4NADPH氧化酶基因及蛋白表達(dá)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，IC

6、A作用EBs2h后能顯著提高細(xì)胞內(nèi)ROS水平，當(dāng)體系中共孵育vitaminE，PDTC或apocynin時(shí)，ICA促ROS產(chǎn)生作用消失。選擇性清除細(xì)胞內(nèi)ROS顯著抑制ICA促心肌細(xì)胞定向分化作用，表現(xiàn)為心肌分化率降低，肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2C(myocyteenhancerfactor2C，MEF2C)基因表達(dá)減少。p38MAPK和ERK1，2磷酸化水平分別在ICA介入培養(yǎng)體系30min或2h后上升至最高，而JNK磷酸化水平在觀察的0～4h內(nèi)

7、無(wú)明顯變化。上述ICA誘導(dǎo)的絲裂素活化蛋白激酶(MAPKs)激活作用均可被vitaminE拮抗。p38MAPK抑制劑SB203580或ERK1，2抑制劑U0126對(duì)信號(hào)通路進(jìn)行選擇性抑制后，能有效拮抗ICA促分化作用，表現(xiàn)為心肌細(xì)胞分化率顯著降低，心肌MEF2C基因表達(dá)顯著減少。 進(jìn)一步研究顯示，ICA和ICT介入分化體系30min后能顯著增加Nox4NADPH氧化酶基因表達(dá)，作用2h后能明顯上調(diào)其蛋白表達(dá)，但I(xiàn)CA和ICT對(duì)其

8、誘導(dǎo)效應(yīng)無(wú)顯著差異。ICT作用后EBs內(nèi)活性氧升高水平，p38MAPK和ERK1，2磷酸化程度均較ICA組少。提示ICA和ICT具有同等效應(yīng)激活細(xì)胞內(nèi)ROS作用(對(duì)NOX4NADPH氧化酶誘導(dǎo)作用相似)，ICT本身具備的抗氧化活性在激活NOX4同時(shí)清除了部分ROS，從而導(dǎo)致其下游p38MAPK和ERK1，2激活效應(yīng)削弱，最終導(dǎo)致其促心肌細(xì)胞定向分化作用相對(duì)較弱。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示ICA、ICT和DICT促心肌細(xì)胞體外定向分化作用物

9、質(zhì)基礎(chǔ)是其母核本身，但母核上羥基位置與數(shù)目差異導(dǎo)致的抗氧化活性差異影響了其誘導(dǎo)小鼠ES細(xì)胞體外定向分化心肌細(xì)胞效應(yīng). 2ROS信號(hào)通路在ICA啟動(dòng)心肌細(xì)胞定向分化中作用研究第一部分研究從化合物構(gòu)效關(guān)系層面進(jìn)一步明確了細(xì)胞內(nèi)ROS水平在ES細(xì)胞體外定向分化心肌細(xì)胞中的作用，基于上述研究結(jié)果，為進(jìn)一步明確ROS信號(hào)通路在ICA促心肌細(xì)胞定向分化過(guò)程中的角色，本部分著重對(duì)核因子-κB(nuclearfactor-κB，NF-κB)，活

10、性蛋白(activationprotein-1，AP-1)，及Ca2+信號(hào)通路進(jìn)行了考察。采用Westernblot法檢測(cè)ICA介入體系后IκBα和p-IκBα表達(dá)，胞質(zhì)和胞核內(nèi)NF-κBp65表達(dá)，及c-fos和c-jun表達(dá)。熒光分光光度計(jì)法檢測(cè)ICA和ICT介入后對(duì)EBs內(nèi)Ca2+水平影響，共孵育Ca2+螯合劑EGTA或胞內(nèi)Ca2+清除劑BAPTA/AM后，評(píng)價(jià)EBs內(nèi)Ca2+水平對(duì)ICA促心肌細(xì)胞定向分化作用影響。Western

11、blot法檢測(cè)ICA介入后EBs內(nèi)鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(calcineurin，CaN)及鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ(Ca2+/calmodulin-dependentkinaseⅡ，CaMKⅡ)表達(dá)，并觀察選擇性抑制CaN及CaMKⅡ后對(duì)ICA誘導(dǎo)ES細(xì)胞體外定向分化為心肌細(xì)胞影響。進(jìn)一步考察ICA介入后EBs內(nèi)組蛋白去乙?；D(zhuǎn)移酶4(histonedeacetylases4，HDACA)表達(dá)及其與CaMKⅡ關(guān)系。最后，共孵育vitaminE、SB20

12、3580或U0126，評(píng)價(jià)ICA誘導(dǎo)心肌細(xì)胞體外定向分化過(guò)程中ROS-MAPKs信號(hào)通路與NF-κB、AP-1及Ca2+信號(hào)通路關(guān)系。 結(jié)果顯示，ICA作用30min后，EBs內(nèi)p-IκBa表達(dá)顯著增加，IκBa表達(dá)顯著減少。ICA與EBs共孵育2h后，胞核內(nèi)NF－κBp65表達(dá)顯著增加，胞漿中表達(dá)相應(yīng)減少。c-fos和c-jun基因或蛋白表達(dá)在ICA作用30min或2h后顯著上調(diào)。 ICA介入5min后細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃

13、度([Ca2+]i)即顯著上升，共孵育EGTA或BAPTA/AM后，發(fā)現(xiàn)其能有效拮抗ICA促心肌細(xì)胞體外定向分化作用，表現(xiàn)為心肌分化率降低，心肌MEF2C核轉(zhuǎn)錄減少，肌小節(jié)蛋白α-輔肌動(dòng)蛋白(α-actinin)和肌鈣蛋白T(Troponin-T)表達(dá)下調(diào)。ICA作用48h后CaN及CaMKⅡ表達(dá)顯著上升，此作用可被EGTA或BAPTA/AM拮抗。選擇性抑制CaMKⅡ顯著拮抗ICA促分化作用，但CaN抑制后對(duì)ICA促分化作用并無(wú)顯著影響

14、。ICA作用48h后HDAC4表達(dá)顯著降低，選擇性抑制CaMKⅡ后能顯著抑制ICA降低HDAC4表達(dá)作用。 共孵育vitaminE后，發(fā)現(xiàn)其能有效拮抗ICA誘導(dǎo)的NF-κB，AP-1激活和[Ca2+]i增加。SB203580或U0126對(duì)信號(hào)通路進(jìn)行選擇性抑制后，ICA誘導(dǎo)NF-κB和AP-1激活作用明顯降低，但對(duì)[Ca2+]i無(wú)顯著影響。 結(jié)果提示，ICA促進(jìn)ES細(xì)胞體外定向分化為心肌細(xì)胞過(guò)程中，一方面，激活的ROS通

15、過(guò)p38MAPK和ERK1，2傳遞信號(hào)，使NF－κB抑制因子IκBα發(fā)生自身磷酸化并迅速降解，NF-κB和IκBα解離，轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，同時(shí)，活化的p38MAPK和ERK1，2上調(diào)c-fos和c-jun表達(dá)；另一方面，ROS通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)Ca2+，活化CaMKⅡ，導(dǎo)致下游HDAC4降解，其對(duì)MEF2C的轉(zhuǎn)錄抑制作用降低，MEF2C轉(zhuǎn)錄活性增加，從而促進(jìn)心肌分化。 以上實(shí)驗(yàn)表明： 1.ICA、ICT和DICT促ES細(xì)胞體外

16、定向分化心肌細(xì)胞作用與其母核本身密切相關(guān)，但母核上羥基位置與數(shù)目差異導(dǎo)致的抗氧化活性差異，可影響該類化合物誘導(dǎo)心肌細(xì)胞定向分化效應(yīng)的強(qiáng)弱。 2.ICA促進(jìn)EBs向心肌細(xì)胞分化過(guò)程中，內(nèi)源性ROS水平迅速升高，一方面，激活的ROs通過(guò)p38MAPK和ERK1，2傳遞信號(hào)，使NF-κB抑制因子IκBα發(fā)生自身磷酸化并迅速降解，NF-κB和IκBα解離，轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，同時(shí)，活化p38MAPK和ERK1，2上調(diào)c-fos,c-jun表