生長(zhǎng)分化因子11對(duì)神經(jīng)細(xì)胞增殖、分化的影響及作用機(jī)制的初探.pdf

1、目的：
　　本研究選擇生長(zhǎng)分化因子11（Growth differentiation factor11，GDF11）與C-C型趨化因子配體11(C-C motif chemokine ligand11，CCL11)兩個(gè)蛋白進(jìn)行研究，首先對(duì)文獻(xiàn)中報(bào)道的R&D公司GDF11抗體的特異性進(jìn)行檢測(cè);然后檢測(cè)正常獻(xiàn)血者血漿中GDF11和CCL11的含量，分析人血液中GDF11和CCL11水平與年齡、性別、血型等的相關(guān)性;利用HT22和C17

2、.2小鼠神經(jīng)細(xì)胞，明確GDF11對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞凋亡、壞死、遷移、增殖、分化等的作用，研究GDF11發(fā)揮作用的信號(hào)通路，初步闡述其作用機(jī)制，探討GDF11在年齡相關(guān)的認(rèn)知功能減退中潛在的應(yīng)用價(jià)值，為后續(xù)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究奠定理論基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.采用SDS-PAGE及Western blot方法檢測(cè)R&D公司GDF11抗體是否具有特異性。
　　2.收集約300例不同年齡、性別、血型的正常獻(xiàn)漿人群的單人份新鮮冰凍血漿，-

3、80℃凍存，待用，避免反復(fù)凍融。采用ELISA方法檢測(cè)血漿中GDF11、CCL11的含量，明確人血液中GDF11與CCL11的含量與年齡、性別、血型等的相關(guān)性。
　　3.用完全培養(yǎng)基（含5％馬血清、10％胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基）將小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞系HT22或神經(jīng)干細(xì)胞系C17.2在37℃和5％CO2條件下培養(yǎng)過(guò)夜后，更換為饑餓培養(yǎng)基（含1％胎牛血清和0.5％馬血清的高糖DMEM）繼續(xù)培養(yǎng)6h，然后①HT22細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組:棄去原

4、有培養(yǎng)基，加入含有不同濃度GDF11(12.5、25、50、100ng/mL)的饑餓培養(yǎng)基培養(yǎng);C17.2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組:分別加100ng/mL NGF，100ng/mL GDF11，25ng/mL GDF11。②對(duì)照組:棄去原有培養(yǎng)基，加入與實(shí)驗(yàn)組相同體積的饑餓培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)6h，24h，36h或48h后，分別進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)。
　　4.GDF11處理96孔板中的HT22和C17.2細(xì)胞24h或48h后，倒置熒光顯微鏡觀察GDF11對(duì)

5、細(xì)胞形態(tài)的影響，通過(guò)Hoechst和PI雙染法測(cè)定細(xì)胞凋亡和壞死情況，采用增強(qiáng)型CCK8法檢測(cè)細(xì)胞活力及增殖情況。
　　5.對(duì)24孔板中的HT22細(xì)胞進(jìn)行人為劃痕損傷實(shí)驗(yàn)，觀察損傷后不同濃度GDF11(12.5，25，50，100ng/mL)對(duì)細(xì)胞向劃痕處遷移能力的影響。
　　6.通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)GDF11刺激12孔板中的HT22和C17.2細(xì)胞6h后細(xì)胞周期蛋白CyclingD2、神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志蛋白

6、nestin、神經(jīng)元標(biāo)志蛋白βⅢ-Tubulin、星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白GFAP及信號(hào)通路蛋白EGFR、Notch1等的mRNA表達(dá)情況。
　　7.利用Western blot方法分析GDF11刺激6孔板中的HT22細(xì)胞后對(duì)TGF-β信號(hào)通路中的Smad2/3以及cAMP應(yīng)答元件結(jié)合蛋白Creb等蛋白的磷酸化的影響。
　　8.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用GraphPad Prism5軟件進(jìn)行圖表繪畫(huà)及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。Western blot

7、條帶采用Image J軟件進(jìn)行灰度分析。目的條帶灰度值經(jīng)對(duì)應(yīng)的內(nèi)參調(diào)整后，計(jì)算磷酸化蛋白與總蛋白的比值，同時(shí)將正常對(duì)照組磷酸化蛋白/總蛋白的比值設(shè)定為1，然后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。多組間比較采用單因素方差分析，雙組間的比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。當(dāng)P＜0.05時(shí)認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.Western blot結(jié)果顯示:R&D公司的GDF11單克隆抗體可結(jié)合GDF8，但與IgG單鏈不具有交叉反應(yīng)。
　　2.ELIS

8、A結(jié)果顯示:人血漿中GDF11水平隨年齡增加呈遞減趨勢(shì)，CCL11含量則隨年齡的增加而增加，并且在男性中顯著高于女性(P＜0.01)，但血型間并無(wú)差異。
　　3.Hoechst和PI雙染結(jié)果顯示:GDF11對(duì)HT22細(xì)胞凋亡、壞死無(wú)影響。
　　4.增強(qiáng)型CCK8檢測(cè)結(jié)果顯示:不同濃度GDF11處理海馬神經(jīng)細(xì)胞系HT22和神經(jīng)干細(xì)胞系C17.248h后，均表現(xiàn)出細(xì)胞活力增強(qiáng)，且有顯著性差異(P＜0.01)，但并無(wú)劑量依賴(lài)。

9、r>　　5.劃痕損傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果:GDF11處理組遷移至劃痕損傷處的細(xì)胞數(shù)量相對(duì)對(duì)照組較少。
　　6.qRT-PCR結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比，不同濃度GDF11處理細(xì)胞6h后，神經(jīng)元標(biāo)志物βⅢ-Tubulin mRNA表達(dá)水平明顯增加(P＜0.01，n=3)，但沒(méi)有劑量依賴(lài)性;細(xì)胞干性標(biāo)志物Nestin表達(dá)有所下降，星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP有所增加，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;細(xì)胞周期標(biāo)志物CyclinD2表達(dá)下調(diào)(P＜0.05，n=3)，但沒(méi)有

10、劑量依賴(lài)性;EGFR、Notch1表達(dá)下降，有顯著性差異(P＜0.05)，且有劑量依賴(lài)性，表明GDF11可能通過(guò)抑制EGFR和Notch等信號(hào)通路對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖分化進(jìn)行調(diào)控。
　　7.Western blot結(jié)果顯示:GDF11組（處理24h）與對(duì)照組相比，Smad2/3和Creb蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化，p-Smad2/3、p-Creb蛋白表達(dá)均顯著增加，但無(wú)顯著的劑量依賴(lài)性，表明不同濃度的GDF11均可激活Smad2/3和Cre

11、b的磷酸化，可能通過(guò)啟動(dòng)TGF-β/Smad2/3、Creb等信號(hào)通路對(duì)小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞的增殖分化進(jìn)行調(diào)控。
　　結(jié)論：
　　1.文獻(xiàn)報(bào)道中的R&D公司的GDF11單克隆抗體不能辨別GDF11和GDF8，但也不會(huì)結(jié)合IgG輕鏈。
　　2.人血漿中GDF11含量隨年齡增加有遞減趨勢(shì)，CCL11含量隨年齡增加而增加，且在相同年齡的前提下男性血漿中含量高于女性，血型之間無(wú)差異。
　　3.GDF11可能通過(guò)抑制Notch