載體構(gòu)建及對(duì)小鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞的影響

1、1MicrNA91慢病毒載體的構(gòu)建及其對(duì)小鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為慢病毒載體的構(gòu)建及其對(duì)小鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞的影響神經(jīng)細(xì)胞的影響景黎君，賈永林，魯晶晶，韓瑞，王舒陽(yáng)，李盡義，彭濤，賈延劼△（鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南鄭州450052）[摘要]目的：目的：探討micrNA91在體外誘導(dǎo)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）向神經(jīng)細(xì)胞分化中的作用。方法:構(gòu)建小鼠micrNA91慢病毒載體（micrNA91LV）并感染小鼠

2、MSCs，篩選最適感染復(fù)數(shù)（MOI）；實(shí)驗(yàn)分為未感染組、感染組（感染micrNA91LV組）、陰性對(duì)照組（感染FURNAiNCLV）；采用β巰基乙醇誘導(dǎo)感染后小鼠MSCs分化為神經(jīng)細(xì)胞。倒置熒光顯微鏡下觀察MSCs感染后熒光表達(dá)情況；采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)神經(jīng)元烯醇化酶（NSE）、神經(jīng)微管結(jié)合蛋白（MAP2）和膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）的表達(dá)變化；PTPCR檢測(cè)MAP2mRNA的表達(dá)變化；MTT方法檢測(cè)細(xì)胞存活率。結(jié)果：結(jié)果：(1)

3、陽(yáng)性克隆PCR證明小鼠micrNA91慢病毒載體構(gòu)建成功，孔稀釋法測(cè)定病毒滴度為11012TUL。(2)倒置顯微鏡下觀察小鼠micrNA91慢病毒載體感染成功，MOI值為20，感染4d時(shí)感染率最高，細(xì)胞存活率較高，感染率可達(dá)91.3%4.2%。(3)β巰基乙醇可以誘導(dǎo)MSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化，其中以感染組誘導(dǎo)效果最佳，NSE和MAP2的表達(dá)率顯著高于其它各組（P0.05）。結(jié)論：結(jié)論：(1)micrNA91可高效感染小鼠MSCs。(2)感

4、染miRNA91LV后MSCs經(jīng)β巰基乙醇誘導(dǎo)向神經(jīng)細(xì)胞分化比率增加。[關(guān)鍵詞關(guān)鍵詞]MicrNA91；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；神經(jīng)元；慢病毒[中圖分類號(hào)中圖分類號(hào)]R329.21[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[基金項(xiàng)目基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.30770758）；河南省教育廳自然科學(xué)研究計(jì)劃項(xiàng)目（No.2008A320032）3micrNA是生物體內(nèi)源的小RNA分子，可以在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平、表觀遺傳學(xué)水平等水平調(diào)控基因組的表

5、達(dá)，參與生命過程中一系列的重要進(jìn)程[1]。誘導(dǎo)骨髓間質(zhì)干細(xì)胞（marrowmesenchymalstemcellsMSCs）分化為神經(jīng)細(xì)胞有可能成為臨床中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療的可行性方法[2]，但其具體機(jī)制尚不清楚，研究發(fā)現(xiàn)MSCs分化為神經(jīng)細(xì)胞過程中，micrNA在其中起著重要調(diào)控作用[3]。MicrNA9在腦組織中表達(dá)較為豐富，研究表明，micrNA9在神經(jīng)干或前體細(xì)胞分化發(fā)育中起著重要作用[4]。MSCs可以向神經(jīng)細(xì)胞方向分化，但是

6、micrNA9是否在MSCs誘導(dǎo)分化中起作用尚不清楚。本研究根據(jù)確定的miRNA91序列，構(gòu)建目的micrNA慢病毒載體，將其感染小鼠MSCs，β巰基乙醇誘導(dǎo)各組細(xì)胞，觀察micrNA9在小鼠MSCs橫向分化為神經(jīng)細(xì)胞中的作用。材料和方法1動(dòng)物動(dòng)物SPF級(jí)BALBc小鼠，雌雄不限，68周齡，1820g，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK(豫)20050001。MSCs由大鼠股骨中分離提取，連續(xù)傳10代以上。293T細(xì)胞和大腸桿

7、菌菌株DH5α由鄭州大學(xué)生物化學(xué)教研室惠贈(zèng)。2主要試劑主要試劑XbaI、HpaI及T4DNA連接酶購(gòu)自NEB；RNA干擾載體pFUGWRNAi和病毒包裝三質(zhì)粒：pGCLV重組載體（同時(shí)可表達(dá)綠色熒光蛋白）、pHelper1.0和pHelper2.0均購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)有限公司；感染試劑Lipofectamine2000購(gòu)自Invitrogen；DMEM液體培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自Gibco；神經(jīng)元烯醇化酶（neuronspecificen

8、olaseNSEH300，sc15343）、神經(jīng)微管結(jié)合蛋白（microtubulinassociatedprotein2MAP2sc20172）、膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glialfibrillaryacidicproteinGFAPH50sc9065）兔抗多克隆抗體購(gòu)自SantaCruz公司；Cy3標(biāo)記山羊抗兔IgG（HL）購(gòu)自上海碧云天公司；RNeasyMini試劑盒、OneStepRTPCR試劑盒均為Qiagen產(chǎn)品；凝聚胺、多聚賴氨