音猬因子方案定向誘導(dǎo)人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞的研究.pdf

1、隨著工業(yè)文明的快速發(fā)展，外傷性脊髓損傷患者的數(shù)量日漸增多，但脊髓損傷的治療卻一直是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的難題，世界各地的醫(yī)務(wù)工作者都在積極探索有效的治療方法。近年來隨著組織工程研究的興起，使用干細(xì)胞組織工程技術(shù)治療脊髓損傷受到了極大關(guān)注，為修復(fù)脊髓損傷提供了新的途徑。其中種子細(xì)胞的選擇與獲取是神經(jīng)組織工程研究的基礎(chǔ)和熱點。目前研究較多的種子細(xì)胞有神經(jīng)干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、骨髓基質(zhì)干細(xì)胞、雪旺細(xì)胞及嗅鞘細(xì)胞等。干細(xì)胞由于具有高度的自我更新與多向分化潛能

2、，成為組織工程研究中重要的靶器官。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞是骨髓中的非生血干細(xì)胞，其起源于中胚層未分化的間充質(zhì)細(xì)胞。由于具有取材便利，來源豐富，易于擴增分離，具有向多種中胚層和神經(jīng)外胚層細(xì)胞分化的能力，且分化后回輸自體時不存在免疫排斥及倫理學(xué)束縛等特點，成為最具潛力的種子細(xì)胞。 本實驗應(yīng)用密度梯度離心法分離培養(yǎng)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，研究其生物學(xué)特性，采用全反式維甲酸、音猬因子和堿性成纖維生長因子8 的不同組合方案誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞定向分化為神經(jīng)

3、細(xì)胞，并進(jìn)一步研究不同組合對細(xì)胞數(shù)量和活性的影響，尋找骨髓基質(zhì)干細(xì)胞定向分化為神經(jīng)細(xì)胞的最佳方案，為神經(jīng)組織工程提供充足、穩(wěn)定的細(xì)胞來源。 實驗第一部分應(yīng)用密度梯度離心法分離骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，培養(yǎng)并傳代觀察。研究并記錄其生長特性和生物學(xué)特點；根據(jù)傳代（P5）后細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征和成骨特性對分離、培養(yǎng)、傳代后的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞綜合鑒定。 結(jié)果證實： 1．實驗應(yīng)用密度梯度離心法分離人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，方法簡便，成本低廉，原代

4、培養(yǎng)成功率高達(dá)100％，所獲取細(xì)胞48h 貼壁率高、生長穩(wěn)定、增殖速度快、形態(tài)較為均一。證實本實驗方法可以穩(wěn)定獲取和擴增人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞。 2．根據(jù)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征、表面特異性抗原和成骨特性對傳代（P5）后細(xì)胞進(jìn)行綜合鑒定，發(fā)現(xiàn)所獲取細(xì)胞外部形態(tài)上都成紡錘形或星形成纖維細(xì)胞狀，形態(tài)較為均一；具有公認(rèn)的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞相對特異性抗原；可以穩(wěn)定誘導(dǎo)分化為骨細(xì)胞，證實所獲取細(xì)胞為具有多向分化潛能的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞。 實驗第二部分為

5、采用全反式維甲酸、音猬因子和堿性成纖維生長因子8的不同組合方案誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞定向分化為神經(jīng)細(xì)胞，并進(jìn)一步研究不同組合對細(xì)胞數(shù)量和活性的影響，尋找骨髓基質(zhì)干細(xì)胞定向分化為神經(jīng)細(xì)胞的最佳方案。 結(jié)果證實： 1．體外使用音猬因子（sonic hedgehog,SHH）可以誘導(dǎo)人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞（神經(jīng)干細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞），且在一定濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴效應(yīng)。C 組組合（SHH 500n

6、g/ml,FGF-8 100ng/ml）為最佳誘導(dǎo)濃度，以較低濃度的誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)產(chǎn)生的神經(jīng)樣細(xì)胞最多。且音猬因子可以促進(jìn)細(xì)胞增殖，提高細(xì)胞成活率。 2．使用SHH 聯(lián)合RA 共同模擬胚胎發(fā)育過程中的體內(nèi)環(huán)境來誘導(dǎo)BMSCs定向分化為神經(jīng)元細(xì)胞，這種組合方法可以進(jìn)一步提高誘導(dǎo)效率，并降低RA對細(xì)胞的毒性，提高細(xì)胞成活率。 本實驗成功、穩(wěn)定的獲取了人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，并對其生物學(xué)特征進(jìn)行了初步分析、鑒定。應(yīng)用音猬因子及音猬因子與