周圍神經(jīng)細(xì)胞懸液對(duì)體外培養(yǎng)的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的影響.pdf

1、背景與目的：帕金森病(PD)是常見(jiàn)的慢性進(jìn)行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)變性疾病之一，病因及發(fā)病機(jī)制不明。其病理學(xué)的變化主要為黑質(zhì)多巴胺(DA)能神經(jīng)元變性、缺失，導(dǎo)致紋狀體DA不足。目前PD的治療策略主要是控制臨床癥狀，這種治療策略不能夠阻止疾病的進(jìn)行性發(fā)展。細(xì)胞移植為PD提供了能夠延緩疾病進(jìn)展甚至根治的方法?？晒┮浦驳募?xì)胞從早期的DA能腎上腺嗜鉻細(xì)胞、胚胎黑質(zhì)細(xì)胞發(fā)展為神經(jīng)干細(xì)胞、骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)，而MSCs作為移植細(xì)胞則具有

2、明顯優(yōu)勢(shì)。MSCs存在于骨髓間質(zhì)中，具有自我復(fù)制能力：不僅可以分化為造血細(xì)胞，在特定條件下還可以分化為非造血細(xì)胞；MSCs來(lái)源豐富、采集方便：可自體回輸，不會(huì)發(fā)生免疫排斥反應(yīng)；體外擴(kuò)增迅速，短時(shí)間內(nèi)可以達(dá)到治療所需的細(xì)胞數(shù)量；容易轉(zhuǎn)入外源基因。因此，MSCs成為細(xì)胞移植治療PD的最理想細(xì)胞來(lái)源之一。目前研究者多采用細(xì)胞因子或化學(xué)藥物等方法調(diào)控MSCs分化，在體外擴(kuò)增到一定數(shù)量級(jí)后再進(jìn)行移植。 微環(huán)境對(duì)于細(xì)胞的分化是最有利的條件。

3、有實(shí)驗(yàn)表明周圍神經(jīng)組織能夠促進(jìn)黑質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)。周圍神經(jīng)中除神經(jīng)軸突外，主要包含雪旺細(xì)胞(SCs)和成纖維細(xì)胞(Fibroblast)。SCs是周圍神經(jīng)系統(tǒng)膠質(zhì)細(xì)胞，掘報(bào)道，SCs能夠分泌20余種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、細(xì)胞外基質(zhì)及細(xì)胞黏附因子，為軸突基質(zhì)提供支持。已證明SCs能夠促進(jìn)神經(jīng)元軸突的再生，誘導(dǎo)軸突再生、延長(zhǎng)，有利于受損神經(jīng)在組織結(jié)構(gòu)上修復(fù)、再生，在功能傳導(dǎo)上再通。SCs在體外具有抑制膠質(zhì)細(xì)胞生成，促進(jìn)神經(jīng)元快速生長(zhǎng)的作用。將人胚胎干細(xì)胞

4、與SCs共同培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)SCs營(yíng)造的微環(huán)境可以誘導(dǎo)大多數(shù)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元。有實(shí)驗(yàn)證實(shí)周圍神經(jīng)可以促進(jìn)黑質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)。研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)FGF-20的SCs能夠促進(jìn)Nurr-1 神經(jīng)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為酪氨酸羥化酶(TH)陽(yáng)性的神經(jīng)元。但是，SCs的獲得存在技術(shù)復(fù)雜、所需試劑昂貴、SCs純度不高等缺陷。 關(guān)于Fibroblast報(bào)道較少。Fibroblast由胚胎時(shí)期的間充質(zhì)細(xì)胞發(fā)展而來(lái)，是結(jié)締組織中最常見(jiàn)的細(xì)胞，具有分泌功能，可以以自分

5、泌和旁分泌的方式產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)成分，如胰島素樣生長(zhǎng)因子-1 (IGF-1)、堿性成纖維生長(zhǎng)因子(bFGF)、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(EGF)等。IGF-1 具有胰島素樣抑制蛋白分解作用，同時(shí)也促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，對(duì)正常組織細(xì)胞的增殖、分化、再塑和維護(hù)起十分重要的作用。IGF-1 可促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的存活，及促進(jìn)視網(wǎng)膜神經(jīng)元的發(fā)育和CNS多級(jí)神經(jīng)元的生成。bFGF、EGF在包括神經(jīng)系統(tǒng)在內(nèi)的各種組織形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用。 目前研究者能夠在體

6、外實(shí)驗(yàn)中將MSCs誘導(dǎo)為神經(jīng)元樣細(xì)胞，表達(dá)神經(jīng)元特有的表面標(biāo)志。本實(shí)驗(yàn)利用細(xì)胞培養(yǎng)模型，模擬體內(nèi)中腦微環(huán)境，將周圍神經(jīng)細(xì)胞懸液與MSCs混合建立共培養(yǎng)體系，觀察MSCs向DA能神經(jīng)元誘導(dǎo)分化的情況，目的是尋求體外誘導(dǎo)MSCs定向分化為DA能神經(jīng)元的最佳條件，為PD的細(xì)胞及基因治療奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法： (1) MScs的分離、培養(yǎng)及純化雄性SD大鼠，無(wú)菌條件下暴露股骨和脛骨骨髓腔，獲取骨髓液。采用貼壁篩選法，將骨髓液接種

7、于含10﹪胎牛血清(FBS)的低糖DMEM(L-DMEM)培養(yǎng)液中，置于37℃、5﹪CO<,2>、飽和濕度的CO<,2>培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24小時(shí)后首次換液。以后每3～4d換液一次，待貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)融合后，胰酶消化傳代。將3～5代的MSCs接種于十二孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)80﹪～90﹪融合時(shí)開(kāi)始進(jìn)行誘導(dǎo)分化。 (2) 周圍神經(jīng)細(xì)胞懸液的獲取2.5﹪苯丙巴比妥鈉腹腔麻醉300～350g重的SD大鼠(雌雄不拘)，無(wú)菌條件下取雙側(cè)坐骨神經(jīng)，

8、用顯微外科鑷子從神經(jīng)束中逐條抽取神經(jīng)纖維剪碎，移入盛有按1∶1比例混合的0.5﹪胰蛋白酶和0.06﹪膠元蛋白酶的離心管內(nèi)37℃水浴90分鐘，加入細(xì)胞培養(yǎng)液終止酶反應(yīng)，離心后將細(xì)胞稀釋成3×10<'5>/L，置于37℃、5﹪CO<,2>、飽和濕度的CO<,2>培養(yǎng)箱中備用。 (3) 實(shí)驗(yàn)分組如下：L-DMEM培養(yǎng)基中加入FBS(體積分?jǐn)?shù)15﹪)和bFGF(10ng/ml)預(yù)誘導(dǎo)MSCs24h后，分為對(duì)照組：不另加任何試劑。實(shí)驗(yàn)組

9、：①M(fèi)SCs+周圍神經(jīng)細(xì)胞懸液組；②MSCs+周圍神經(jīng)細(xì)胞懸液+中腦條件培養(yǎng)基組。 整個(gè)誘導(dǎo)過(guò)程中，于倒置顯微鏡下密切觀察細(xì)胞形態(tài)變化，并在誘導(dǎo)第7d時(shí)進(jìn)行神經(jīng)元特異性烯醇化酶抗體(NSE)、TH免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)。分別計(jì)數(shù)NSE、TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分比。 結(jié)果： (1) MSCs在體外條件培養(yǎng)呈增殖性生長(zhǎng)，傳代后貼壁迅速，3～4d擴(kuò)增1倍。 (2) bFGF預(yù)誘導(dǎo)24h后細(xì)胞數(shù)量明顯增加，

10、部分細(xì)胞形態(tài)變?yōu)殚L(zhǎng)梭形；部分細(xì)胞具有神經(jīng)元形態(tài)學(xué)特征：折光性增強(qiáng)，胞體逐漸變成卵圓形或圓形，不帶突起或向兩極伸出突起。 (3) 各實(shí)驗(yàn)組于誘導(dǎo)7d后出現(xiàn)不同數(shù)量的NSE、TH陽(yáng)性神經(jīng)元樣細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組NSE細(xì)胞陽(yáng)性率、TH細(xì)胞陽(yáng)性率有顯著差異。 (4) 對(duì)照組未見(jiàn)TH陽(yáng)性細(xì)胞，MSCs+周圍神經(jīng)細(xì)胞懸液組可見(jiàn)少量TH陽(yáng)性細(xì)胞，MSCs+周圍神經(jīng)細(xì)胞懸液+中腦條件培養(yǎng)基組可見(jiàn)數(shù)量較多的TH陽(yáng)性細(xì)胞。 結(jié)