骨髓基質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞分化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制研究.pdf

1、目的：神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)是具有分化為神經(jīng)元細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞的能力，可自我更新并提供腦組織細(xì)胞的干細(xì)胞。NSCs的出現(xiàn)為臨床治療神經(jīng)退行性疾病以及神經(jīng)系統(tǒng)損傷帶來了新的希望。但無論是體外還是體內(nèi)研究的結(jié)果，NSCs分化為神經(jīng)元的比例都明顯低于膠質(zhì)細(xì)胞，致使難以達(dá)到理想的替代因損傷和疾病等原因造成的神經(jīng)元缺失的目的。 骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSCs)是來源于骨髓的多潛能干細(xì)胞，其主要功能是支持和營養(yǎng)造血細(xì)胞。近年來研究

2、發(fā)現(xiàn)BMSCs能分泌許多細(xì)胞因子如腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、堿性成纖維生長因子(bFGF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、白細(xì)胞介素(IL)等，而且這些細(xì)胞因子對NSCs的分化、存活及增殖也有一定影響。本實(shí)驗(yàn)室研究已證實(shí)BMSCs能夠誘導(dǎo)中腦NSCs分化為高比例神經(jīng)元，并且是BMSCs分泌至培養(yǎng)液中的可溶性分子在這一過程中發(fā)揮了重要作用，但究竟是這些可溶性分子通過什么途徑在起作用目前尚不清楚。 絲裂酶原活化蛋白激酶(MAP

3、K)普遍存在于多種生物細(xì)胞內(nèi)，MAPK將細(xì)胞外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至胞內(nèi)，從而參與細(xì)胞的生長、分化和細(xì)胞凋亡等過程。 本實(shí)驗(yàn)旨在利用Neurobasal培養(yǎng)液制成的BMSCs條件培養(yǎng)液(N-CM)培養(yǎng)NSCs，通過在培養(yǎng)體系中加入MAPKs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抑制劑，觀察其對NSCs分化為神經(jīng)元和星型膠質(zhì)細(xì)胞的影響，明確MAPKs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在這一過程中的作用，初步探討了BMSCs調(diào)節(jié)NSCs分化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。 方法：分離SD大鼠股骨和

4、脛骨，沖洗骨髓腔，將細(xì)胞懸液離心后種入75mi培養(yǎng)瓶內(nèi)。取3～6代的BMSCs，待細(xì)胞鋪滿瓶底85％后，棄去培養(yǎng)液，更換為Neurobasal培養(yǎng)液6ml，培養(yǎng)24h后，離心收集上清即為N-CM。取新生大鼠中腦，機(jī)械分散成單細(xì)胞后，離心棄上清，加入DMEM/F12(1:1)添加2％B27的無血清培養(yǎng)基，同時(shí)加入20ng/mlbFGF，將細(xì)胞種入培養(yǎng)瓶中。在分離培養(yǎng)7d左右單個(gè)的NSCs便可增殖形成球體(NSCs球)。此后，每5～7d傳代

5、1次。將二代或三代NSCs球均勻種植于預(yù)先包被多聚賴氨酸的35 mm培養(yǎng)皿中，待NSCs球貼壁后更換培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)分為三組： (1)自然分化組：用單純Neurobasal培養(yǎng)液培養(yǎng)NSCs； (2)對照組：用N-CM培養(yǎng)NSCs； (3)抑制劑組：在N-CM培養(yǎng)的NSCs中分別加入三種MAPKs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制劑，濃度為：PD98059 5μM，SB203580 4μM，Genistin 4μM。 培養(yǎng)3d

6、后，進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色。在倒置熒光顯微鏡下每個(gè)培養(yǎng)皿隨機(jī)選擇10個(gè)視野，分別計(jì)數(shù)每個(gè)視野內(nèi)MAP-2及GFAP陽性細(xì)胞數(shù)和同一個(gè)視野中的細(xì)胞總數(shù)，得到該視野陽性細(xì)胞百分比。各組實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，進(jìn)行相同的計(jì)數(shù)過程，最后取均值。結(jié)果采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，所有計(jì)量資料均采用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組之間采用t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，以p<0.05為差異有顯著性。 結(jié)果： 1.N-CM對NSCs分化的影響自然分化組中細(xì)胞

7、總體生長狀態(tài)很差，細(xì)胞核多有固縮、破碎。神經(jīng)元稀少，體積小、突起不明顯。遷移距離較近，多聚集在一起。星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量多，突起粗，多聚集在神經(jīng)球的中央，呈放射狀排列。這兩種細(xì)胞占神經(jīng)干細(xì)胞球中分化出的細(xì)胞的大多數(shù)。而用N-CM培養(yǎng)NSCs，細(xì)胞生長狀況良好，細(xì)胞核大小均一，很少有破碎。神經(jīng)元較自然分化組多，突起較長，遷移距離遠(yuǎn)，分布較均勻。星形膠質(zhì)細(xì)胞較自然分化組數(shù)量少，胞體細(xì)長，分布較分散。N-CM組NSCs分化為神經(jīng)元的比例為(34.

8、26±9.3 1％)，高于自然分化組(18.02±7.69％)；星形膠質(zhì)細(xì)胞的比例為(36.92±10.14％)，低于自然分化組(60.11±8.99％)，說明N-CM對NSCs分化為神經(jīng)元具有上調(diào)作用，而對星形膠質(zhì)細(xì)胞有抑制作用。 2.含三種抑制劑的N-CM誘導(dǎo)NSCs分化PD98059組和SB203580組細(xì)胞生長狀況較好，胞核較均一，有少量破碎。神經(jīng)元較對照組數(shù)量少，突起不明顯，遷移距離不遠(yuǎn)，分布尚均勻，這兩組NSCs分化

9、為神經(jīng)元的比例為(20.37±9.25％)和(22.14±8.47％)均明顯低于對照組(34.26±9.31％)。星形膠質(zhì)細(xì)胞粗大、扁平，突起多，形態(tài)不規(guī)則，較對照組數(shù)量多，遷移距離遠(yuǎn)，分布分散。這兩組NSCs分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞的比例為(47.43±11.45％)和(48.72±10.58％)均明顯高于對照組(36.92±10.14％)。而Genistin組與對照組相比，神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)、遷移距離及數(shù)量統(tǒng)計(jì)均無明顯差別。