大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化及自體移植治療顳葉癲癇實驗研究.pdf

1、南方醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化及自體移植治療顳葉癲癇實驗研究姓名：王煥明申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：神經(jīng)外科學(xué)指導(dǎo)教師：徐如祥20070428中文摘要海馬功能的修復(fù)重建實驗研究，可以從一個新的角度來探索治療、改善顳葉癲癇發(fā)作頻率和程度的途徑，具有潛在的臨床意義。第一部分大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為神經(jīng)干細(xì)胞實驗研究一、目的探討大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞在體外培養(yǎng)并誘導(dǎo)分化為神經(jīng)干細(xì)胞的可行性，并確立骨髓基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)分

2、化為神經(jīng)干細(xì)胞的適當(dāng)培養(yǎng)方法及條件，為其在組織工程學(xué)研究和臨床醫(yī)學(xué)中的廣泛應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。二、材料與方法以S D 大鼠為實驗對象，無菌穿刺大鼠股骨骨髓腔抽取骨髓，梯度密度離心獲得有核細(xì)胞，粘附法提取骨髓基質(zhì)細(xì)胞。向提取的骨髓基質(zhì)細(xì)胞懸液加入神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞濃度到1 0 6 個／m l 后，接種于多孔培養(yǎng)板中，再分別加胎牛血清( 1 ％終濃度) 、L I F ( 1 0 n g ／m 1 ) 及b F G F ( 1 0 n g

3、／m 1 ) 。在3 7 “ ( 2 、5 ％C 0 2 、飽和濕度條件下培養(yǎng)骨髓基質(zhì)細(xì)胞，4 8 h 后換液以去除非黏附細(xì)胞，以后每周換液2 次。原代培養(yǎng)一周后進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)的細(xì)胞加入胎牛血清以及R A ( 0 ．5 u g ／m i ) ，以誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞分化。然后在C K 2 型倒置光學(xué)顯微鏡下追蹤觀察培養(yǎng)的活細(xì)胞生長情況并拍照。采用s A B C 法進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)檢測，將不同階段培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)4 ％多聚甲

4、醛固定，0 ．0 1 M P B S 沖洗，一抗3 7 “ C ，孵育6 0 r a i n ，生物素化二抗室溫孵育1 0 m i n ，最后在鏈霉親和素．生物素．過氧化酶復(fù)合物室溫孵育1 0 m i n ，經(jīng)D A B 顯色5 ～1 5m i n ，并在O L Y M P U S 光學(xué)顯微鏡下觀察拍照。三、結(jié)果貼壁細(xì)胞培養(yǎng)4 8 h 后有分裂增殖，然后逐漸形成島嶼狀細(xì)胞克隆團(tuán)，給予適當(dāng)?shù)姆只瘲l件l O ～2 0 d 后，這些細(xì)胞能分化