星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)干細(xì)胞共培養(yǎng)對神經(jīng)干細(xì)胞分化影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、前言
　　 神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells,NSCs)的特點(diǎn):能夠自我更新和增殖；具有向神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞多向分化的潛能；免疫原性低；可長期培養(yǎng)。
　　 神經(jīng)干細(xì)胞的作用:促進(jìn)神經(jīng)組織的修復(fù)；作為神經(jīng)系統(tǒng)疾病基因治療的載體。
　　 神經(jīng)干細(xì)胞存在于哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的多個部位。大鼠海馬是神經(jīng)干細(xì)胞的主要聚集區(qū),利于獲取神經(jīng)干細(xì)胞。新生大鼠海馬所占腦體積的比例較成鼠.大,便于取材。
　　

2、 星形膠質(zhì)細(xì)胞能合成和分泌多種神經(jīng)因子,促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的定向分化,對神經(jīng)元的正?；顒优c代謝都有重要作用。大腦皮質(zhì)是星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元密切接觸的主要場所,從大腦皮質(zhì)獲取星形膠質(zhì)細(xì)胞,有利于認(rèn)識星形膠質(zhì)細(xì)胞的生物學(xué)作用。
　　 神經(jīng)干細(xì)胞作為治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病理想的供體細(xì)胞,其作用主要是通過神經(jīng)干細(xì)胞分化的神經(jīng)元實(shí)現(xiàn)。神經(jīng)干細(xì)胞的分化是神經(jīng)干細(xì)胞的重要屬性之一,受諸多因素影響,但在很大程度上取決于微環(huán)境中神經(jīng)因子的作用。
　　

3、 目的
　　 探討星形膠質(zhì)細(xì)胞(Astrocytes)對誘導(dǎo)新生大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元的影響。
　　 材料和方法
　　 一、材料
　　 新生2-3d的正常Wistar大鼠12只。
　　 二、方法
　　 (一)神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定
　　 新生2.3d的Wistar大鼠,無菌分離海馬組織,制成細(xì)胞懸液,在含堿性成纖維生長因子(basic fibroblast growth

4、factor,bFGF)、表皮生長因子(epidermal growthfactor,EGF)和B27的DMEM/F12(1:1)無血清培養(yǎng)基中進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞的原代培養(yǎng)。原代培養(yǎng)細(xì)胞大多數(shù)細(xì)胞球直徑達(dá)200μm時行傳代培養(yǎng),傳3代的細(xì)胞球行單克隆培養(yǎng)?？寺∏虻牟糠旨?xì)胞行巢蛋白(Nestin)免疫細(xì)胞熒光染色；部分細(xì)胞用含10％胎牛血清的DMEM/F12進(jìn)行誘導(dǎo)分化,5d后分別行神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neurone specific en

5、olase,NSE)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidicprotein,GFAP)、半乳糖腦苷脂(galactocerebroside,Galc)免疫細(xì)胞熒光染色。
　　 (二)星形膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)液的收集
　　 新生2-3d的Wista大鼠,無菌分離出大腦皮質(zhì),制成細(xì)胞懸液,在含DMEM/F12(1:1)、15％胎牛血清的培養(yǎng)液中行星形膠質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng)。用差速貼壁和室溫震蕩法純化星形膠質(zhì)

6、細(xì)胞。傳3代后部分細(xì)胞行GFAP免疫細(xì)胞熒光染色,標(biāo)記星形膠質(zhì)細(xì)胞的純度；另一部分細(xì)胞換成NSCs培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48h,收集細(xì)胞培養(yǎng)液即為星形膠質(zhì)細(xì)胞的條件培養(yǎng)液(ACM)。
　　 (三)神經(jīng)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)
　　 將單克隆培養(yǎng)的NSCs分為三組:對照組(A組)、ACM:NSCs(1:2)培養(yǎng)組(B組)和Astrocytes和NSCs共培養(yǎng)組(C組)。各組細(xì)胞分別接種于含不同培養(yǎng)液的六孔培養(yǎng)板的板孔中,進(jìn)行誘導(dǎo)分化培

7、養(yǎng)。采用免疫細(xì)胞熒光染色及免疫蛋白印跡兩種檢測方法,檢測各組NSCs分化為神經(jīng)元的比例及其NSE蛋白的表達(dá)情況。
　　 (四)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件,對神經(jīng)元的比例進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±f)表示,組間比較采用t檢驗(yàn),P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 一、神經(jīng)干細(xì)胞的鑒定結(jié)果
　　 單細(xì)胞克隆培養(yǎng)的細(xì)胞Nestin陽性表達(dá),誘導(dǎo)分

8、化的細(xì)胞NSE、GFAP和GalC陽性表達(dá)。
　　 二、星形膠質(zhì)細(xì)胞鑒定結(jié)果
　　 GFAP免疫細(xì)胞熒光染色顯示:96.5％細(xì)胞GFAP陽性,細(xì)胞純度適合做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　 三、各組神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化的結(jié)果
　　 各組神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化3d時,細(xì)胞貼壁分化的程度不同:B組、C組明顯比A組快；誘導(dǎo)分化7d時,免疫細(xì)胞熒光染色統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果表明:A組、B組、C組NSE陽性細(xì)胞的比例分別為:14.7％±3.5％