Lentivirus病毒載體感染骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)和定向分化.pdf

1、第一部分大鼠骨髓問質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)和鑒定 實(shí)驗(yàn)一:大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的分離和培養(yǎng) 目的：分離和培養(yǎng)大鼠的骨髓問質(zhì)干細(xì)胞。掌握原代細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)，了解干細(xì)胞的生物學(xué)特性。 材料和方法：四月齡的SD大鼠，沿用Friedenstein的方法，利用問質(zhì)干細(xì)胞粘附于組織培養(yǎng)板的特性，首先利用梯度離心分離出單核細(xì)胞，再利用干細(xì)胞粘附于塑料培養(yǎng)板的特點(diǎn)，獲得較純的貼壁生長的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞。 結(jié)果：細(xì)胞貼壁較快，呈克隆

2、生長，細(xì)胞形態(tài)為均一的長梭形。在接種24小時后可見成纖維狀的細(xì)胞以散在的方式貼壁，2—3天就可見一些集落形成，7-10天后集落迅速增多，并且逐漸長大融合成片。隨著集落生長的不斷擴(kuò)大而融合為單層。傳代培養(yǎng)后細(xì)胞不再以成集落的方式生長，而是呈均勻分布生長。原代培養(yǎng)結(jié)束時細(xì)胞數(shù)為105左右，P10代細(xì)胞數(shù)約為1012左右。 結(jié)論：大鼠骨髓問質(zhì)干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)技術(shù)成熟，細(xì)胞增殖能力旺盛。 實(shí)驗(yàn)二:大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的鑒

3、定 目的：通過表面抗原檢測確定培養(yǎng)細(xì)胞的正確性。為下一步實(shí)驗(yàn)確定良好的種子細(xì)胞。 材料和方法：通過流式細(xì)胞儀檢測大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的表面抗原，包括CD29，CD44，CD90，CDi05，CD34，CD45，CDllb，組織相容性復(fù)合體I、H。 結(jié)果：與對照組相比，大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞表面抗原CD29，CD44，CD90，CDl05顯示陽性，而表面抗原CD34，CD45，CDllb為陰性，組織相容性復(fù)合體I、II均

4、為陰性。 結(jié)論：大鼠骨髓問質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志為非單一性，表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和表皮細(xì)胞的表面標(biāo)志，一般認(rèn)為整合素家族成員CD29，粘附分子CD44、CDl05以及胸腺和外周T淋巴細(xì)胞標(biāo)志CD90等是骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的重要標(biāo)志物。 第二部分腺病毒和慢病毒載體感染骨髓問質(zhì)干細(xì)胞的比較 目的：攜帶綠色熒光蛋白(GFP)基因的慢病毒和腺病毒載體系統(tǒng)感染大鼠骨髓問質(zhì)干細(xì)胞，觀察感染后GFP的表達(dá)情況及持續(xù)時間，比較兩種載體的

5、優(yōu)缺點(diǎn)。 材料和方法：重組質(zhì)粒pHIV—CS—CDF—CG～PRE(含有GFP基因)及包裝質(zhì)粒pRSV—Rev，pMDLg/pPRE，pMD．G在293細(xì)胞感染和收集病毒顆粒；腺病毒載體(含有GFP基因)自購，分別感染大鼠骨髓問質(zhì)干細(xì)胞，觀察GFP蛋白表達(dá)情況；流式細(xì)胞儀檢測GFP表達(dá)情況。 結(jié)果：感染一周，慢病毒和腺病毒系統(tǒng)對大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的感染效率均較高，熒光蛋白表達(dá)良好，慢病毒GFP表達(dá)90％，腺病毒達(dá)到71％

6、，；三周后，慢病毒系統(tǒng)干細(xì)胞的感染表達(dá)良好，約83．2％，但腺病毒系統(tǒng)的感染表達(dá)已明顯下降，僅達(dá)到0．13％，；五周后，慢病毒系統(tǒng)的感染表達(dá)仍保持良好，約79％，而腺病毒僅剩O．05％。。 結(jié)論：慢病毒載體系統(tǒng)對大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞感染后GFP表達(dá)和持續(xù)時間明顯高于腺病毒載體系統(tǒng)， 第三部分人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2基因的慢病毒載體構(gòu)建 目的：將人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2基因克隆到新型慢病毒載體中，用于下一步的基因治療方面的

7、研究． 材料和方法：從肝臟組織中抽提總RNA后；設(shè)計NheI、AgeI雙酶切位點(diǎn)引物，擴(kuò)增出BMP一2的全長序列，克隆到慢病毒重組質(zhì)粒pHIV—CS—CDF—CG—PRE，通過PCR、酶切、測序等方法篩選鑒定重組質(zhì)粒。 結(jié)果：成功擴(kuò)增出1．2kb左右的BMP一2全長序列，序列比對分析與Genebank中humanBMP一2閱讀框架序列100％吻合。 第四部分?jǐn)y帶hBMP2基因的慢病毒載體的包裝和體外表達(dá)

8、目的：包裝慢病毒載體、測定其病毒滴度、檢測其蛋白表達(dá)情況。 材料和方法：重組質(zhì)粒pHIV～CS—CDF—CG—PRE(含有hBMP2基因)，包裝質(zhì)粒pRSV—Rev，pMDLg/pPRE，pMD．G在293T細(xì)胞感染和收集病毒顆粒。用ELISA的方法檢測慢病毒的滴度。間接免疫熒光分析和WESTERNBLOTTING分析檢測hBMP2基因的體外表達(dá)情況。 結(jié)果：慢病毒載體系統(tǒng)包裝順利，經(jīng)測定其滴度為2．92×10。，間接免

9、疫熒光分析和WESTERNBLOTTING分析hBMP2基因的表達(dá)情況良好。 第五部分?jǐn)y帶tfilMP2基因的慢病毒感染骨髓間質(zhì)-T細(xì)胞的定向分化 目的：觀察慢病毒載體誘導(dǎo)rMSCs后的變化情況，檢測rMSCs是否按預(yù)期方向向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化。 材料和方法：含有hBMP2基因的慢病毒載體誘導(dǎo)rMSCs，誘導(dǎo)第O、3、6、9、12、15、18、2l天測定堿性磷酸酶的活性及細(xì)胞染色情況；采用鈣的定量測定沉積鈣的濃度；免

10、疫組化分析工型膠原蛋白表達(dá)情況。 結(jié)果：誘導(dǎo)后的rMSCs，隨著大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)時間的延長，其堿性磷酸酶的活性逐漸增加，染色良好，而未經(jīng)病毒誘導(dǎo)的干細(xì)胞，培養(yǎng)21天，其堿性磷酸酶的活性無明顯的變化；誘導(dǎo)組Ca2+的濃度持續(xù)升高，到第15天后Ca2+的濃度達(dá)到最大，此后達(dá)到平穩(wěn)期，未誘導(dǎo)組鈣沉積無明顯變化；誘導(dǎo)組I型膠原蛋白表達(dá)明顯增加，染色呈陽性，而未誘導(dǎo)組無明顯變化。 結(jié)論：通過免疫組化和組織化學(xué)技術(shù)證明，誘導(dǎo)的