低氧對神經(jīng)干細胞增殖和分化的影響及HIF-1的作用機制.pdf

1、神經(jīng)干細胞(NSC)是具有高度自我更新能力和多項分化潛能的神經(jīng)前體細胞。它能最終分化形成神經(jīng)元、星形膠質細胞和少突膠質細胞，因此對治療神經(jīng)退行性疾病和損傷有著廣闊的應用前景，目前已成為神經(jīng)系統(tǒng)領域的研究熱點。而氧是生命存在的必要條件，也是細胞生理功能的一種重要調節(jié)因子，氧濃度的變化可影響細胞的功能狀態(tài)。目前關于低氧作用的研究多集中在低氧對細胞的損傷和有關的適應機制方面，而關于低氧在細胞增殖和分化中的作用研究較少，特別是關于低氧對NSCs

2、增殖和分化的影響目前還不太清楚。低氧誘導因子一l(HIF—1)是細胞低氧反應的核心調控因子，諸多研究表明它在腫瘤細胞增殖中起著重要的調控作用，但關于它是否參與低氧對NSCs增殖和分化的影響國內外未見報道。因此本研究利用各種細胞分子生物學手段，比較了不同氧濃度對NSCs增殖和分化的影響，觀察了低氧后NSCs內HIF-la的表達變化，并探討HIF一1α在低氧引起的NSCs增殖和分化中的作用。 一、神經(jīng)干細胞分離、培養(yǎng)和鑒定以及低氧濃

3、度測定 Wistar孕大鼠(E13．5d)戊巴比妥鈉麻醉后，無菌條件下取出胎鼠，分離胎鼠中腦NSCs。傳3代后，制成單細胞懸液，在涂有多聚賴氨酸(0．1mg／m1)的confocal皿中貼壁半小時，4％多聚甲醛固定后，用免疫組化進行Nestin鑒定，鑒定結果表明幾乎所有細胞均為Nestin染色陽性，說明培養(yǎng)的NSCs較純，可用于下面的實驗。 把通過以上方法得到的NSCs分別置于不同環(huán)境氧濃度中(20％02，10％02，3

4、％O2，0％O2)，培養(yǎng)3d后，分別用血氣分析儀和自動生化分析儀測定細胞培養(yǎng)上清中的氧分壓和乳酸濃度。氧分壓依次為153±7、105±5、80±10和65±15mmHg；乳酸濃度依次為O．875±0．251、L425±0．¨2、1．825±0．220和2．096±O．233mmol幾。由以上結果可以看出，隨著環(huán)境氧濃度的下降，細胞培養(yǎng)上清中的氧分壓隨之下降，而乳酸濃度隨之增高，在環(huán)境氧濃度為O％02時，細胞培養(yǎng)上清的乳酸濃度達2．096

5、mmol／L。乳酸濃度過高不利于細胞生長，因此在以下的實驗中，采用10％和3％氧濃度來觀察低氧對NSCs增殖和分化的影響。 二、低氧對神經(jīng)干細胞增殖的影響及HIF-1的作用 細胞分組后分別置于常氧(20％02)和低氧(10％O2，3％02)環(huán)境中，培養(yǎng)3d后，采用神經(jīng)球記數(shù)、Brdu摻入和流式細胞術(測定增殖指數(shù))等方法觀察NSCs的增殖情況。神經(jīng)球記數(shù)結果表明：10％和3％的氧濃度可明顯促進神經(jīng)球的形成，其增殖的神經(jīng)球

6、數(shù)目分別為常氧組的2．5和1．5倍；BrdU摻入結果表明，在低氧環(huán)境中BrdU標記的陽性細胞數(shù)目明顯高于對照組；增殖指數(shù)結果表明，10％低氧組明顯高于對照組，而3％低氧組低氧早期增殖被抑制，經(jīng)過一段時間的適應后，增殖指數(shù)有所增加，但仍不如10％低氧組明顯。 鑒于10％低氧促NSCs增殖作用更為明顯，因此我們觀察了10％低氧條件下NSCs內HIF-1α的表達變化。RT-PCR結果表明：從低氧6h開始，HIF-1αmRNA水平比對照

7、組明顯增加；Westernblot分析結果表明：常氧條件下，幾乎檢測不到HIF-i~蛋白的表達，而低氧組在低氧6-72h內都可以檢測到HIF-1α蛋白的表達。以上結果提示，HIF-1可能在低氧促NSCs增殖中起著重要的調控作用。 為了進一步證明HIF-1在低氧促NSCs增殖中的作用，用攜帶HIF-1α基因的Ad5腺病毒載體和針對HIF-I~mRNA的pSilencerTMU6／Neo／GFP／RNAi質粒載體分別過表達和抑表達H

8、IF-1α，并觀察其對常氧或低氧條件下NSCs增殖的影響。增殖指數(shù)和細胞記數(shù)的結果表明：HIF一1α過表達可促進常氧或低氧條件下NSCs的增殖；而抑制HIF一1α的表達可阻斷低氧條件下NSCs的增殖。由以上結果得出結論：HIF-1參與了低氧促NSCs增殖的調控；且HIF-1具有不依賴低氧的促NSCs增殖的作用。 三、低氧對神經(jīng)干細胞分化的影響及HIF-1的作用 取第三代神經(jīng)干細胞，分別置于常氧(20％02)和低氧(10％

9、02，3％02)條件下，在誘導液中培養(yǎng)3d后，各組記數(shù)種于涂膠皿并改用分化液，分化成熟5-7天后，用免疫組化、FACS和HPLC檢測NSCs的分化方向。組化和FACS結果表明，在低氧環(huán)境中培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞與常氧組相比可分化為更多的神經(jīng)元和較少的神經(jīng)膠質細胞，從神經(jīng)元類型上看低氧可促進神經(jīng)干細胞向TH陽性神經(jīng)元方向分化，且以3％低氧條件下更為明顯；HPLC檢測培養(yǎng)上清中DA濃度的結果表明，10％低氧組與對照組無明顯差異，3％低氧組細胞培養(yǎng)

10、上清中DA的濃度比對照組明顯增加以上結果表明，低氧(3％)促進NSCs向多巴胺能神經(jīng)元方向分化。 TH是轉錄因子HIF-1的靶基因，又是多巴胺合成過程中關鍵的限速酶，因此為了探討低氧(3％)促進NSCs向多巴胺能神經(jīng)元方向分化的機制，觀察了3％低氧條件下NSCs內HIF-I~的表達變化。RT-PCR結果表明：在低氧過程中，HIF一1αmRNA表達水平無明顯變化；Westernblot分析結果表明：常氧條件下，幾乎檢測不到HIF-

11、i~蛋白的表達，而低氧組在低氧3—72h內都可以檢測到HIF-la蛋白的表達。以上結果提示，HIF-1可能在低氧(3％)促進NSCs向多巴胺能神經(jīng)元方向分化中起著重要的調控作用。 為了進一步證明HIF-1在低氧促NSCs向多巴胺能神經(jīng)元方向分化中的作用，用攜帶HIF一1α基因的Ad5腺病毒載體過表達HIF-1α，觀察其對常氧或低氧條件下NSCs分化方向的影響。FACS和HPLC檢測結果表明：HIF-1α過表達可促進常氧或低氧條件

12、下NSCs向多巴胺能神經(jīng)元方向分化。由以上結果得出結論：HIF-1參與了低氧條件下NSCs向多巴胺能神經(jīng)元方向的分化；且在常氧條件下HIF-1即可通過上調TH的表達來促進NSCs向多巴胺能神經(jīng)元方向的分化。 綜上所述，低氧對NSCs的增殖和分化均有影響，且NSCs對不同低氧濃度的反應是不一樣的。就增殖而言，10％O2促進了NSCs的增殖，且HIF-1參與了其促NSCs增殖的調控；就分化而言，3％02促進NSCs向神經(jīng)元方向特別是