葉酸對體外神經(jīng)干細胞分化作用機制的研究.pdf

1、目的：
　　 本實驗主要研究葉酸(Folic acid)對體外培養(yǎng)神經(jīng)干細胞(neural stem cells，NSCs)分化方向的影響，探討葉酸基于DNA甲基化途徑調(diào)控NSCs分化的機制。為NSCs移植和定向分化提供科學依據(jù)。
　　 方法：
　　 采用無血清細胞培養(yǎng)法，培養(yǎng)新生大鼠海馬NSCs，用SOX2和BrdU免疫熒光雙標鑒定，并將NSCs分為5組:①對照組(folic acid-free differe

2、ntiationmedium，Control)，②低葉酸組(low folic acid，8μg/mL，F(xiàn)A-L)，③高葉酸組(highfolic acid，32μg/mL，F(xiàn)A-H)，④低葉酸加甲基阻斷劑組(8μg/mL folic acid and150nmol/mLzebularine，F(xiàn)AL-Z)，⑤高葉酸加甲基阻斷劑組(32μg/mL folic acid and150nmol/mLzebularine，F(xiàn)AH-Z)。在分化第

3、1天加甲基阻斷劑作用，48h后換正常培養(yǎng)液，收集分化第6天細胞。分別采用免疫熒光(Immunofluorescent，IF)和免疫印跡(Western Blot)檢測神經(jīng)元的特異性標志物β-tubulinⅢ和星形膠質(zhì)細胞的特異性標志物GFAP的表達;采用DNA甲基化定量試劑盒檢測不同葉酸濃度下細胞總甲基化水平;甲基轉(zhuǎn)移酶活性檢測試劑盒檢測DNMTs總活性，WesternBlot檢測DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransfera

4、ses，DNMTs)的蛋白表達;用高效液相法(HPLC)檢測細胞內(nèi)S-腺苷甲硫氨酸(s-adenosylmethionine，SAM)、S-腺苷同型半胱氨酸(s-adenosylhomocysteine，SAH)的水平;Western Blot檢測JAK-STAT通路中信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子STAT(Signal transducers and activators oftranscription，STAT)中STAT1和STAT3的磷

5、酸化水平;采用MeDIP-qPCR(甲基化DNA免疫共沉淀-實時定量PCR)檢測GFAP基因啟動子的甲基化水平。
　　 結果：
　　 采用無血清培養(yǎng)法體外細胞培養(yǎng)6d后，細胞聚集成球形團塊，邊緣發(fā)亮，折光性強，呈懸浮狀態(tài)，經(jīng)SOX2和BrdU免疫熒光雙標記法鑒定呈雙陽性。體外誘導分化后，免疫熒光標記和Western Blot檢測結果顯示:與對照組相比，低葉酸組和高葉酸組的β-tubulinⅢ陽性表達率均增加，GFAP的陽

6、性表達率均減少，低葉酸加甲基阻斷劑組和高葉酸加甲基阻斷劑組β-tubulinⅢ陽性表達率均減少，GFAP的陽性表達率均增加，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);低葉酸加甲基阻斷劑組與低葉酸組相比，低葉酸加甲基阻斷劑組β-tubulinⅢ陽性表達率下降，GFAP陽性表達率增加，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);高葉酸加甲基阻斷劑組與高葉酸組相比，高葉酸加甲基阻斷劑組β-tubulinⅢ陽性表達率下降，GFAP陽性表達率增加，差異均有統(tǒng)計

7、學意義(P＜0.05)。DNA總甲基化水平檢測結果顯示:與對照組相比，低葉酸組和高葉酸組細胞總甲基化水平均增加，且高葉酸組總甲基化水平高于低葉酸組，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。DNMTs總活性檢測結果顯示:與對照組相比，低葉酸組和高葉酸組的DNMTs總活性均增強，低葉酸加甲基阻斷劑組和高葉酸加甲基阻斷劑組的DNMTs總活性均降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);低葉酸加甲基阻斷劑組與低葉酸組相比，低葉酸加甲基阻斷劑組DNMT

8、s總活性顯著降低，高葉酸加甲基阻斷劑組與高葉酸組相比，高葉酸加甲基阻斷劑組DNMTs總活性下降，且高葉酸加甲基阻斷劑組DNMTs總活性高于低葉酸加甲基阻斷劑組，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。Western Blot檢測DNMTs的蛋白表達，結果顯示:與對照組相比，DNMT1和DNMT3a的蛋白表達在低葉酸組和高葉酸組均增加，DNMT3b的蛋白表達僅在高葉酸組增加，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。HPLC檢測結果顯示:與對照組相

9、比，低葉酸組和高葉酸組的SAM水平升高，SAH的水平降低，SAM/SAH的比值增加，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。Western Blot檢測p-STAT1，p-STAT3表達，結果顯示:與對照組相比，高葉酸組p-STAT3的表達下降，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);p-STAT1在各組中的表達無顯著改變，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。MeDIP-qPCR檢測結果顯示:與對照組相比，低葉酸組和高葉酸組GFAP基因啟動子甲基化

10、水平升高，且高葉酸組高于低葉酸組，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 結論：
　　 本實驗結果顯示，葉酸減少體外神經(jīng)干細胞向神經(jīng)膠質(zhì)方向分化，進而增加向神經(jīng)元方向分化比例。其可能的機制是:葉酸通過增加DNMT1，DNMT3a/3b蛋白的表達提高DNMTs總活性水平，通過改變甲基化途徑中關鍵代謝物SAM和SAH濃度，促進甲基化反應的發(fā)生，提高星形膠質(zhì)細胞GFAP基因啟動子的甲基化水平，同時降低p-STAT3的表達，