血管生成素2對胎鼠腦皮層神經(jīng)干細胞誘導分化作用及其分子機制的研究.pdf

1、【目的】
　　神經(jīng)干細胞（Neural stem cells,NSCs）具有多向分化能力，可代償損傷后的神經(jīng)細胞并重建被破壞的神經(jīng)系統(tǒng)環(huán)路，被廣泛認為是可用于治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)（Central nervous system,CNS）損傷，如脊髓損傷（Spinal cord injury,SCI）,最具潛力的種子細胞。然而，如何調(diào)控神經(jīng)干細胞的分化及分化方向，促進其向神經(jīng)元方向分化，進而最大化修復受損神經(jīng)組織，仍是當前亟待解決的重大問

2、題。近年的研究發(fā)現(xiàn)，曾被認為是僅參與生理性和病理性血管形成的血管生成素2（Angiopoietin2,Ang2），在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育及再生修復的過程中亦發(fā)揮著重要的促進性作用。本課題通過分離培養(yǎng)E12.5天的胎鼠腦皮層神經(jīng)干細胞，研究Ang2對胎鼠腦皮層神經(jīng)干細胞的誘導分化作用及分化方向；并進一步研究其誘導分化作用的分子機制，應用PI3K-AKT-mTOR信號通路特異性抑制劑，觀察Ang2對胎鼠腦皮層神經(jīng)干細胞誘導分化作用的改變，探討

3、PI3K-AKT-mTOR信號通路在Ang2誘導神經(jīng)干細胞分化作用中的關鍵機制。
　　【方法】
　　本實驗首先對C57BL/6J胎鼠（E12.5天）腦皮層神經(jīng)干細胞進行原代分離、培養(yǎng)與純化，通過體外培養(yǎng)形態(tài)學觀察、Nestin免疫細胞化學染色鑒定、以及神經(jīng)干細胞分化能力的鑒定；改良凍存與復蘇神經(jīng)干細胞的配方與方法，并對經(jīng)過不同凍存時間的神經(jīng)干細胞（0，1，6，12月）進行形態(tài)學觀察及分化能力的鑒定。實驗使用經(jīng)過兩代無血清培養(yǎng)

4、純化后的神經(jīng)干細胞，將其接種于包被有多聚賴氨酸（Poly-L-lysine,PLL）的培養(yǎng)孔板及培養(yǎng)皿中，使用含有Ang2的分化培養(yǎng)基進行分化培養(yǎng)，利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）、免疫細胞化學染色及免疫印跡試驗（Westernblot）等技術，觀察Ang2對胎鼠腦皮層神經(jīng)干細胞的誘導分化方向及分化效率，并使用Image-Pro Plus6.0軟件及Quantity One軟件量化、比較神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)

5、細胞的分化比例。同時通過免疫細胞化學染色、Western blot、流式細胞術（Flow cytomery）等技術，利用PI3K-AKT-mTOR信號通路的特異性抑制劑LY294002與Rapamycin，觀察 Ang2對神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元方向誘導分化作用的改變，研究PI3K-AKT-mTOR信號通路在Ang2誘導神經(jīng)干細胞分化作用中的機制。
　　【結(jié)果】
　　實驗成功分離純化胎鼠（E12.5天）腦皮層神經(jīng)干細胞，通過形態(tài)學

6、觀察、Nestin與神經(jīng)干細胞分化能力的免疫細胞化學染色鑒定，證實其具有神經(jīng)干細胞特性；改良后的凍存與復蘇神經(jīng)干細胞配方與方法有效，經(jīng)過不同凍存時間的神經(jīng)干細胞（0,1,6,12月）形態(tài)一致，神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞的分化能力無統(tǒng)計學差異（p>0.05）。通過使用針對神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞的特異性細胞標志物（βⅢ-tubulin，MAP2;GFAP;CNPase）進行細胞免疫熒光染色及Western b

7、lot檢測，證實經(jīng)過Ang2誘導處理的神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元分化的細胞比例及蛋白表達均顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義（p<0.001;p<0.001），而神經(jīng)干細胞向星形膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞分化的細胞比例與蛋白表達均無統(tǒng)計學意義上的改變（p>0.05;p>0.05）。利用PI3K-AKT-mTOR信號通路的特異性抑制劑LY294002與Rapamycin，證實mTOR作為PI3K-AKT信號通路的關鍵分子，介導Ang2對神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元方

8、向的誘導分化。
　　【結(jié)論】
　　本實驗證實Ang2具有顯著促進E12.5天的胎鼠腦皮層神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元方向分化的作用，同時不影響其向星形膠質(zhì)細胞及少突膠質(zhì)細胞方向的分化；PI3K-AKT-mTOR信號通路在Ang2對神經(jīng)干細胞分化方向的調(diào)控作用中發(fā)揮重要作用，mTOR作為PI3K-AKT信號通路的關鍵分子，介導Ang2對神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元方向的誘導分化作用。課題證實Ang2調(diào)控神經(jīng)干細胞分化及其分化方向，提高神經(jīng)干細胞向