胚鼠神經(jīng)干細(xì)胞對(duì)老年小鼠初級(jí)聽(tīng)皮層的影響.pdf

1、背景
　　老年性聾是隨著年齡增長(zhǎng)而出現(xiàn)的雙耳進(jìn)行性聽(tīng)力下降,為臨床的常見(jiàn)病,嚴(yán)重影響著老年人的生活質(zhì)量。聽(tīng)力下降常削弱交換信息,造成孤獨(dú)、分離、依賴、挫折及溝通障礙,使得此類(lèi)人群抑郁癥的患病率明顯升高。隨著我國(guó)社會(huì)老齡化的加劇,老年性聾逐步演變?yōu)橐粋€(gè)日益嚴(yán)重的問(wèn)題。目前尚沒(méi)有治療老年性聾的有效和可靠的方法,這已成為亟待解決的問(wèn)題。
　　神經(jīng)干細(xì)胞移植可誘導(dǎo)受損大腦組織再生,可能成為治療神經(jīng)退行性病變最有前途的治療工具。治療證

2、據(jù)包括:移植的神經(jīng)干細(xì)胞通過(guò)對(duì)抗大腦損傷造成的炎性反應(yīng),減輕大腦損傷,間接保護(hù)大腦組織;移植的神經(jīng)干細(xì)胞可分化為神經(jīng)元,直接對(duì)損傷的大腦組織及凋亡組織起到修復(fù)作用;神經(jīng)干細(xì)胞移植后可以分泌多種神經(jīng)生長(zhǎng)因子,對(duì)周?chē)M織細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng),有效促進(jìn)新生神經(jīng)元的再生;神經(jīng)干細(xì)胞移植后可對(duì)抗細(xì)胞凋亡。研究顯示,神經(jīng)干細(xì)胞移植后凋亡細(xì)胞明顯減少,并且凋亡蛋白表達(dá)明顯減少。鑒于神經(jīng)干細(xì)胞移植的多方面的修復(fù)和促進(jìn)作用,它已成為研究的熱點(diǎn),而且可能成為治療神

3、經(jīng)退行性疾病包括老年性聾及神經(jīng)損傷性疾病的新方法。
　　基于以上研究,本研究將培養(yǎng)的胚鼠神經(jīng)干細(xì)胞移植入老年鼠模型C57BL/6J老年鼠的初級(jí)聽(tīng)皮層區(qū)域,通過(guò)免疫熒光技術(shù)對(duì)移植的神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行追蹤,觀察分化情況。對(duì)其進(jìn)行聽(tīng)功能檢查,觀察效果。檢測(cè)聽(tīng)皮層區(qū)域caspase-3、bcl-2及β-catenin蛋白表達(dá)變化,對(duì)移植治療的機(jī)制進(jìn)行初步的探討。
　　研究目的
　　1.探討胚鼠神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)方法,即分離培養(yǎng)胚鼠腦神

4、經(jīng)干細(xì)胞,尋找便捷、快速的方法。
　　2.對(duì)分離培養(yǎng)的胚鼠神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行鑒定,即鑒定培養(yǎng)的細(xì)胞是否為神經(jīng)干細(xì)胞,確定分離培養(yǎng)方法的可靠性。
　　3.探討神經(jīng)干細(xì)胞對(duì)老年小鼠初級(jí)聽(tīng)皮層的影響,即神經(jīng)干細(xì)胞移植后對(duì)老年小鼠聽(tīng)功能的作用及其可能的作用機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)方法
　　1.選取孕14-15d的孕鼠,在無(wú)菌條件下取出胚鼠,分離胚鼠大腦皮層,分別用酶消化法及機(jī)械吹打法培養(yǎng),對(duì)分離下來(lái)的神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),用CCK

5、8分別檢測(cè)兩種方法分離培養(yǎng)的細(xì)胞增殖情況。
　　2.用免疫熒光技術(shù)對(duì)酶消化法分離培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞特異性標(biāo)志物巢蛋白(nestin)檢測(cè),分離培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞去除生長(zhǎng)因子,并加入胎牛血清誘導(dǎo)其分化,培養(yǎng)7天后,利用免疫熒光技術(shù)對(duì)其進(jìn)行神經(jīng)元特異性標(biāo)志物β微管蛋白Ⅲ(β-tubulinⅢ)和星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)檢測(cè)。
　　3.利用立體定向技術(shù)把培養(yǎng)的胚鼠神經(jīng)干細(xì)胞移植入老年鼠初級(jí)聽(tīng)皮層

6、區(qū)域,移植1周、2周、3周、4周后對(duì)小鼠進(jìn)行ABR聽(tīng)功能檢測(cè)。利用免疫熒光、westernblot、TUNEL、HE染色等技術(shù)觀察移植后神經(jīng)干細(xì)胞分化情況、神經(jīng)元凋亡情況、腫瘤形成情況、相關(guān)蛋白表達(dá)變化情況。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　1.酶消化法分離下來(lái)的神經(jīng)干細(xì)胞比機(jī)械吹打法多,機(jī)械吹打法分離的神經(jīng)干細(xì)胞雜質(zhì)比較多,CCK8檢測(cè)顯示酶消化法分離培養(yǎng)的細(xì)胞比機(jī)械吹打法增殖快。酶消化法分離培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞增殖成神經(jīng)干細(xì)胞球,形態(tài)比較

7、規(guī)則;而機(jī)械吹打法分離的神經(jīng)干細(xì)胞由于雜質(zhì)的影響成云片樣生長(zhǎng),不規(guī)則,經(jīng)多次傳代后才能形成規(guī)則的神經(jīng)干細(xì)胞球。
　　2.神經(jīng)干細(xì)胞自我增殖為神經(jīng)干細(xì)胞球,經(jīng)免疫熒光鑒定后顯示nestin陽(yáng)性。神經(jīng)干細(xì)胞可誘導(dǎo)分化為β-tubulinⅢ免疫陽(yáng)性的神經(jīng)元及GFAP免疫陽(yáng)性的星形膠質(zhì)細(xì)胞。
　　3.胚鼠神經(jīng)干細(xì)胞移植后,移植組的老年鼠聽(tīng)功能得到部分恢復(fù),聽(tīng)力閾值降低,特別是高頻聽(tīng)力比較明顯。移植的神經(jīng)干細(xì)胞可分化為β-tubuli

8、nⅢ免疫陽(yáng)性的神經(jīng)元,移植1周后β-catenin蛋白表達(dá)升高。移植2周、3周后caspase-3蛋白表達(dá)降低,移植2周、3周、4周后bcl-2蛋白表達(dá)升高,并且神經(jīng)元凋亡減少。移植2周后針孔損傷愈合,且移植半年后未見(jiàn)腫瘤生長(zhǎng)。
　　結(jié)論
　　1.胚鼠神經(jīng)干細(xì)胞分離培養(yǎng)時(shí),酶消化法比機(jī)械吹打法更便捷、快速,獲得的神經(jīng)干細(xì)胞多且雜質(zhì)少。
　　2.分離培養(yǎng)的胚鼠神經(jīng)干細(xì)胞可成功誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞,具有自我增殖和