葉酸通過MAPK信號(hào)通路對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化作用的研究.pdf

1、目的: 研究葉酸對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞(neuralstemcells，NSCs)增殖、分化、凋亡作用的影響及加入U(xiǎn)0126作用下葉酸對(duì)NSCs增殖、分化作用的影響，并探討其機(jī)制。 1.建立體外神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)模型。2.通過鏡下初步觀察、MTT法檢測(cè)葉酸對(duì)NSCs增殖的影響。3.通過共聚焦激光掃描熒光雙重染色，計(jì)數(shù)雙陽性細(xì)胞比例檢測(cè)NSCs分化情況。4.通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)葉酸對(duì)NSCs凋亡率影響。 方法: 1.NSC

2、s原代培養(yǎng)方法建立：通過機(jī)械吹打法獲得胚胎鼠、新生鼠大腦皮質(zhì)NSCs，利用含有bFGF和EGF因子的無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞，獲得NSCs。 2.試驗(yàn)分組：選用孕鼠、新生鼠大腦皮質(zhì)NSCs。分為四組：①正常對(duì)照組(Control組)；②葉酸低劑量組(Folate-L組)；③葉酸高劑量組(Folate-H組)；④葉酸缺乏組(MTX組)。U0126作用下，分組為：①正常對(duì)照組(Control組)；②U0126組(U0126)；③U012

3、6+低劑量葉酸組(U0126+lowfolicacid，U0+LFA)；④U0126+高劑量葉酸組(U0126+highfolicacid，U0+HFA)。首先收集應(yīng)用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的增殖6d的部分細(xì)胞，然后將剩余的NSCs細(xì)胞加血清使之分化，繼續(xù)培養(yǎng)6d，收集分化的神經(jīng)細(xì)胞。 3.葉酸對(duì)NSCs增殖的研究：倒置顯微鏡下初步觀察葉酸對(duì)NSCs增殖影響，MTT法觀察葉酸對(duì)NSCs增殖的影響并繪制生長曲線。 4.葉酸對(duì)NS

4、Cs分化的研究：倒置顯微鏡下初步觀察葉酸對(duì)NSCs分化影響，共聚焦激光掃描熒光雙重染色觀察葉酸對(duì)NSCs分化為神經(jīng)元和星型膠質(zhì)細(xì)胞比例的影響。 5.葉酸對(duì)胚胎鼠NSCs凋亡的影響：流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。 結(jié)果: 1.通過機(jī)械吹打法、含bFGF、EGF的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的NSCs表達(dá)Nestin抗原，BrdU標(biāo)記顯示有增殖能力，能分化為表達(dá)β-tubulin-III的神經(jīng)元和GFAP的星型膠質(zhì)細(xì)胞，證明所培養(yǎng)的

5、細(xì)胞為NSCs。 2.葉酸對(duì)體外培養(yǎng)的胚胎大鼠和新生鼠NSCs增殖作用的研究：MTT結(jié)果顯示：4μg/ml、40μg/ml濃度的葉酸均促進(jìn)NSCs增殖，40μg/ml作用明顯，MTX抑制胚胎大鼠和新生鼠NSCs的增殖；U0126作用下，對(duì)照組U0126組比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，U0+LFA和U0+HFA與U0126比較差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 3.葉酸對(duì)體外培養(yǎng)的胚胎大鼠和新生鼠NSCs分化作用的

6、共聚焦激光掃描熒光雙重染色研究結(jié)果： ①葉酸對(duì)胚胎鼠NSCs向星型膠質(zhì)細(xì)胞分化的比例：Folate-H組與Control組比較，F(xiàn)olate-H組與Folate-L組比較，F(xiàn)olate-H組與MTX組比較，差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。葉酸對(duì)新生鼠NSCs向星型膠質(zhì)細(xì)胞分化的比例：Folate-H組與Control組比較，MTX組與Folate-L組比較，MTX組與Folate-H組比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

7、 ②U0126作用下，葉酸對(duì)胚胎鼠NSCs向星型膠質(zhì)細(xì)胞分化的比例：Control組與U0126組比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其余各組之間差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。葉酸對(duì)新生鼠NSCs向星型膠質(zhì)細(xì)胞分化的比例：Control組與U0126組比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其余各組之間差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 ③葉酸對(duì)胚胎鼠NSCs向神經(jīng)元分化的比例：各組之間比較，差別均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

8、P>0.05)。葉酸對(duì)新生鼠NSCs向神經(jīng)元分化的比例：各組之間比較，差別均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 4.流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示胚胎鼠NSCs凋亡率：增值期，F(xiàn)olate-L和Folate-H與Control組比較，兩組凋亡率均低于Control組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，F(xiàn)olate-L和Folate-H與MTX組比較，兩組凋亡率均低于MTX組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。分化期，Control組與Folat

9、e-L組、Folate-H組和MTX組三組之間比較，Control組凋亡率高于Folate-L組、Folate-H組凋亡率，而低于MTX組凋亡率，差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，F(xiàn)olate-L和Folate-H與MTX組比較，兩組凋亡率均低于MTX組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 結(jié)論: 1.本試驗(yàn)成功的分離了胚胎鼠及新生鼠大腦NSCs，胚胎鼠和新生鼠均具有神經(jīng)干細(xì)胞的基本特征：表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞特異性標(biāo)志蛋白N

10、estin；具有分裂增殖能力；可以分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。 2.葉酸促進(jìn)體外培養(yǎng)的孕14-16d胚胎大鼠和24h內(nèi)新生鼠NSCs增殖，加入U(xiǎn)0126作用下，U0126抑制葉酸誘導(dǎo)NSCs增殖的作用，提示葉酸可能通過MAPK通路起到促進(jìn)NSCs增殖的作用。 3.葉酸促進(jìn)體外培養(yǎng)的孕14-16d胚胎大鼠和24h內(nèi)新生鼠NSCs向星型膠質(zhì)細(xì)胞方向分化，而向神經(jīng)元方向分化作用不明顯。葉酸可能通過MAPK信號(hào)通路促進(jìn)體外培養(yǎng)的