Wnt信號(hào)通路對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞神經(jīng)分化作用的研究.pdf

1、[目的]
　　 構(gòu)建雙表達(dá)基因慢病毒載體pLV.EX3d.P/puro-EF1A>WNT3a>IRES/eGFP，用攜帶目的基因Wnt-3a及示蹤基因eGFP的慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human bone marrow mesenchymal stem cells，hBMSCs)，建立能夠持續(xù)激活Wnt信號(hào)通路的體外細(xì)胞模型，觀察其對(duì)hBMSCs神經(jīng)分化的影響。
　　 [方法]
　　 密度梯度離心加差速貼壁

2、法體外分離和純化hBMSCs，原代培養(yǎng)2周后傳代。觀察細(xì)胞形態(tài)特征，繪制生長(zhǎng)曲線，觀察成骨、成脂及成軟骨誘導(dǎo)，流式細(xì)胞儀鑒定其表面抗原。
　　 基于GatewayTM技術(shù)構(gòu)建雙表達(dá)慢病毒載體pLV.EX3d.P/puro-EF1A>WNT3a>IRES/eGFP，經(jīng)293FT包裝并釋放出病毒，將其轉(zhuǎn)導(dǎo)hBMSCs。
　　 設(shè)置轉(zhuǎn)導(dǎo)組、未轉(zhuǎn)導(dǎo)組以及對(duì)照組，采用bFGF以及抗氧化劑BHA聯(lián)合誘導(dǎo)方案，誘導(dǎo)hBMSCs神經(jīng)分化

3、，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。RT-PCR法分別測(cè)定神經(jīng)誘導(dǎo)前，誘導(dǎo)3h，誘導(dǎo)6h，誘導(dǎo)后維持培養(yǎng)24h不同時(shí)點(diǎn)中Wnt-3a、β-catenin、GSK-3β的mRNA表達(dá)水平。免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)(IFC)觀察Wnt-3a對(duì)hBMSCsβ-catenin亞細(xì)胞分布的影響；測(cè)定神經(jīng)細(xì)胞特異性標(biāo)志物Nestin，NSE，NF，beta-Ⅲ Tubulin，GFAP的不同時(shí)點(diǎn)表達(dá)水平變化規(guī)律。觀察激活Wnt信號(hào)通路后對(duì)hBMSCs神經(jīng)分

4、化的影響。
　　 [結(jié)果]
　　 密度梯度離心和差速貼壁法分離、純化培養(yǎng)的hBMSCs呈梭狀，具有均質(zhì)性好，細(xì)胞增殖活力強(qiáng)、傳代生長(zhǎng)快的特點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)的hBMSCs生長(zhǎng)曲線呈S形，且P5細(xì)胞活性較好；成骨誘導(dǎo)13天，茜素紅染色呈紅色結(jié)節(jié)，成脂誘導(dǎo)7天，油紅。染色呈橙紅色，成軟骨誘導(dǎo)21天，阿利新藍(lán)染色可見大多數(shù)細(xì)胞呈現(xiàn)天藍(lán)色，胞質(zhì)內(nèi)可見深染顆粒；流式細(xì)胞儀檢測(cè)hBMSCs表面抗原，結(jié)果顯示CD29、CD44、CD105

5、陽(yáng)性，CD34、CD45陰性。
　　 經(jīng)測(cè)序證實(shí)目的基因Wnt-3a及示蹤基因eGFP片段按正確方向重組入目的載體中，雙表達(dá)慢病毒載體pLV.EX3d.P/puro-EF1A>WNT3a>IRES/eGFP在293FT細(xì)胞中包裝成功，獲得成熟的病毒顆粒，測(cè)得病毒滴度為4.25×107TU/ml。用含Wnt-3a/eGFP的病毒上清分別以不同MOI轉(zhuǎn)導(dǎo)hBMSCs，結(jié)果表明MOI2.0組的轉(zhuǎn)導(dǎo)效果最好。RT-PCR證實(shí)hBMSCs

6、-Wnt3a過(guò)表達(dá)wnt-3a。
　　 神經(jīng)誘導(dǎo)后大部分細(xì)胞表現(xiàn)為富有突起的錐狀細(xì)胞，突起延伸交織成網(wǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)狀況良好。相對(duì)于未轉(zhuǎn)導(dǎo)組，轉(zhuǎn)導(dǎo)組細(xì)胞出現(xiàn)出現(xiàn)軸突二級(jí)分支及典型神經(jīng)元樣細(xì)胞形態(tài)的時(shí)間較早，從神經(jīng)元樣細(xì)胞總體數(shù)量上看，轉(zhuǎn)導(dǎo)組也優(yōu)于未轉(zhuǎn)導(dǎo)組，但生長(zhǎng)狀態(tài)與未轉(zhuǎn)導(dǎo)組基本相同。對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)無(wú)改變。
　　 RT-PCR檢測(cè)Wnt-3a、GSK-3β、β-catenin的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果表明：在神經(jīng)誘導(dǎo)的條件下，

7、轉(zhuǎn)導(dǎo)組Wnt-3a的表達(dá)持續(xù)增強(qiáng)，誘導(dǎo)后維持培養(yǎng)24h達(dá)到高峰。與之相對(duì)應(yīng)，GSK-3β的表達(dá)逐漸下調(diào)，β-catenin則逐漸上調(diào)。IFC檢測(cè)結(jié)果表明：hBMSCs-Wnt3a在神經(jīng)誘導(dǎo)的過(guò)程中存在β-catenin胞內(nèi)積聚及核內(nèi)轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象，表明成功激活經(jīng)典Wnt信號(hào)通路；同時(shí)顯示，隨著誘導(dǎo)進(jìn)程的推移，神經(jīng)干細(xì)胞表面標(biāo)志Nestin逐漸下調(diào)，神經(jīng)元樣細(xì)胞表面標(biāo)志NSE，NF，beta-Ⅲ Tubulin表達(dá)明顯增強(qiáng)，星形膠質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)

8、志GFAP也有所增加。相對(duì)于未轉(zhuǎn)染組，這種變化更為明顯，提示W(wǎng)nt信號(hào)通路能夠有效促進(jìn)hBMSC神經(jīng)分化。
　　 [結(jié)論]
　　 建立了穩(wěn)定的hBMSCs分離培養(yǎng)體系，攜帶目的基因Wnt-3a及示蹤基因增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(eGFP)的慢病毒可以穩(wěn)染人hBMSCs，構(gòu)建了能夠持續(xù)激活Wnt信號(hào)通路的體外細(xì)胞模型。聯(lián)合誘導(dǎo)方案可體外誘導(dǎo)hBMSCs分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞以及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，PT-PCR及IHC結(jié)果提示W(wǎng)nt-3a激