經(jīng)典Wnt信號通路在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成牙本質(zhì)樣細(xì)胞中的作用體外實驗研究.pdf

1、各種原因?qū)е碌难例X缺損或缺失仍是目前很常見的牙科疾患，而傳統(tǒng)的治療尚具有一些無法避免的遠(yuǎn)期礙害。以干細(xì)胞為基礎(chǔ)的再生醫(yī)學(xué)是未來治療這類疾患的理想模式。牙齒再生的干細(xì)胞源分為牙源性干細(xì)胞和非牙源性干細(xì)胞。牙源性干細(xì)胞具有良好的成牙潛能，但是獲取困難限制了牙源性干細(xì)胞的應(yīng)用，因此研究非牙源性干細(xì)胞具有了現(xiàn)實意義。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）與牙源性干細(xì)胞在細(xì)胞生物學(xué)特性

2、上有諸多相似之處，且具有取材容易、獲得方便的優(yōu)越性，在骨組織、牙周組織再生等研究中受到廣泛關(guān)注。本實驗采用牙胚細(xì)胞條件培養(yǎng)液（tooth germ cells conditioned medium,TGC-CM）體外誘導(dǎo)BMSCs，探討其向成牙本質(zhì)樣細(xì)胞分化的能力。同時通過干預(yù)經(jīng)典Wnt通路，觀察BMSCs牙向分化情況的改變，明確經(jīng)典Wnt通路對BMSCs向成牙本質(zhì)樣細(xì)胞分化的調(diào)控作用。
　　實驗分為兩個部分：
　　1．構(gòu)建

3、骨髓間充質(zhì)細(xì)胞向成牙本質(zhì)樣細(xì)胞分化體外誘導(dǎo)體系
　　目的：探索BMSCs向成牙本質(zhì)樣細(xì)胞分化的能力。
　　方法：TGC-CM誘導(dǎo)SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞7d，應(yīng)用免疫熒光染色、RT-PCR等方法，檢測誘導(dǎo)后的細(xì)胞成牙本質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志牙本質(zhì)涎蛋白(DSP)、牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1（DMP-1）表達(dá)水平，明確骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能否向成牙本質(zhì)樣細(xì)胞分化。
　　結(jié)果:大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在誘導(dǎo)體系中生長狀態(tài)良好。培養(yǎng)7d后，部分細(xì)胞

4、抗牙本質(zhì)涎蛋白(DSP)、牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1（DMP-1）免疫熒光染色呈陽性；RT-PCR顯示mRNA水平表達(dá)牙本質(zhì)涎磷蛋白(DSPP)和牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白(DMP-1)。
　　結(jié)論:大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在牙胚細(xì)胞條件培養(yǎng)液的誘導(dǎo)下可以分化為成牙本質(zhì)樣細(xì)胞。
　　2．經(jīng)典Wnt信號通路對骨髓間充質(zhì)細(xì)胞分化為成牙本質(zhì)樣細(xì)胞的調(diào)控作用
　　目的：研究經(jīng)典Wnt信號通路在BMSCs分化為成牙本質(zhì)樣細(xì)胞中的調(diào)控作用。
　　方法

5、：應(yīng)用Wnt3a/Dkk1處理BMSCs48h，Western blot檢測β-catenin水平；應(yīng)用TGC-CM誘導(dǎo)處理前后的BMSCs7d，免疫熒光及熒光實時定量PCR檢測誘導(dǎo)后細(xì)胞成牙本質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志牙本質(zhì)涎蛋白(DSP)、牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1（DMP-1）表達(dá)情況。
　　結(jié)果：Western blot結(jié)果顯示W(wǎng)nt3a/Dkk1處理后BMSCs胞核內(nèi)β-catenin水平明顯上調(diào)/下調(diào)；免疫熒光及熒光實時定量PCR結(jié)果顯示