Notch信號(hào)通路在內(nèi)耳干細(xì)胞增殖分化中的作用.pdf

1、第一部分、小鼠內(nèi)耳干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、鑒定
　　 目的：建立小鼠內(nèi)耳干細(xì)胞體外培養(yǎng)的模型。
　　 方法：取剛出生的小鼠耳蝸基底膜，體外于無(wú)Ca、Mg的D-Hanks溶液中進(jìn)行分離，單細(xì)胞懸液置于含有2％B27、1％N2、50ng/mlIGF-1、20ng/ml EGF、10ng/ml bFGF的DMEM∶F12(1∶1)培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)。用Abcg2、Brdu免疫熒光法鑒定內(nèi)耳干細(xì)胞。
　　 結(jié)果：所取的小鼠耳蝸

2、基底膜單細(xì)胞可形成集落樣生長(zhǎng)的內(nèi)耳干細(xì)胞球，Abcg2、Brdu免疫細(xì)胞化學(xué)染色陽(yáng)性。
　　 結(jié)論：新生小鼠基底膜可以體外誘導(dǎo)出表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記的球體，具有自我更新能力，可能為內(nèi)耳干細(xì)胞。
　　 第二部分、Notch信號(hào)對(duì)內(nèi)耳干細(xì)胞增殖及干性維持的調(diào)節(jié)
　　 目的：探討Notch信號(hào)通路對(duì)內(nèi)耳干細(xì)胞增殖的影響以及對(duì)干細(xì)胞干性的維持。
　　 方法：內(nèi)耳干細(xì)胞培養(yǎng)，一組加含DMSO的培養(yǎng)基，一組加含DAPT的培

3、養(yǎng)基，觀察兩組球體的數(shù)量、大小，用Brdu、Active-notch1、Myosin7a免疫熒光法觀察兩組細(xì)胞表達(dá)的差異。
　　 結(jié)果：球體增殖期有Active-notch1的表達(dá)，DMSO組干細(xì)胞球體數(shù)量與DAPT組無(wú)差別，球體體積DMSO組比DAPT組大，DMSO組Brdu陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較DAPT組明顯增多，DAPT組表達(dá)myosin7a，DMSO組不表達(dá)myosin7a。
　　 結(jié)論：notch信號(hào)通路的活化抑制內(nèi)耳干

4、細(xì)胞球體的增殖，維持內(nèi)耳干細(xì)胞的干性。
　　 第三部分、Notch信號(hào)對(duì)內(nèi)耳干細(xì)胞分化的作用
　　 目的：探討notch信號(hào)通路對(duì)內(nèi)耳干細(xì)胞分化的影響。
　　 方法：內(nèi)耳干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)7天后，收集接種蓋玻片上進(jìn)行貼壁分化，分為兩組，一組加含DMSO的分化培養(yǎng)基，一組加含DAPT的分化培養(yǎng)基，分化7天后，用myosin7a、P27kip1、F-actin免疫熒光法觀察兩組細(xì)胞表達(dá)的差異。
　　 結(jié)果